0 %

Изменение уровня маркеров оксидативного стресса у пациентов с хронической венозной недостаточностью на фоне терапии диосмином

05.11.2018

Cтатья в формате PDF

В основе патогенеза многих нарушений в человеческом организме лежит свободнорадикальное окисление и вызванный им оксидативный стресс. Нивелировать последствия этих процессов могут антиоксиданты, к числу которых относится и натуральный флавоноид – ​диосмин.

Диосмин широко применяется при различных сосудистых патологиях и особенно хорошо зарекомендовал себя у пациентов с хронической венозной недостаточностью (ХВН). Благодаря своей антиоксидантной активности он нейтрализует действие свободных радикалов, а следовательно, снижает уровень биомаркеров оксидативного стресса: простагландинов и их предшественников – ​изопростанов. Именно изменение их уровня в крови оценивалось у пациентов с ХВН на фоне терапии диосмином.

Качественный анализ проводился с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (HPLC-MS). По результатам исследования было отмечено статистически значимое снижение уровня изопростана через 3 мес лечения в основной группе, однако наиболее впечатляющие результаты удалось получить среди курящих пациентов.

Введение

Диосмин (диосметин 7-O-рутинозид) – ​натуральный флавоноид, представитель семейства Рутовых (Rutaceae), в большом количестве содержащийся в цитрусовых. Впервые был выделен в 1925 г. из Норичника узловатого (Scrophularia nodosa). Сегодня также может быть получен путем дегидрогенезации другого флавоноида – ​гесперидина. Широкий спектр биологических свойств диосмина подтвержден в многочисленных исследованиях in vitro и in vivo, где кроме основного антиоксидантного действия он показал антигипергликемический, противовоспалительный, антимутагенный и противоязвенный эффекты.

Выраженное положительное влияние диосмина на сердечно-сосудистую систему делает его сегодня одним из наиболее предпочтительных препаратов в лечении ХВН – ​прогрессирующего заболевания, частота которого с каждым годом увеличивается. ХВН характеризуется морфологическими и функциональными нарушениями венозной системы, проявляющимися варикозным расширением вен, отеками, структурными изменениями кожных покровов нижних конечностей и образованием трофических язв.

На первой стадии заболевания отмечается устойчивая венозная гипертензия, обусловленная главным образом клапанной недостаточностью. За счет рефлюкса венозной крови увеличивается гидростатическое давление и кровоток в микроциркуляторном русле. Это способствует адгезии лейкоцитов к эндотелию капилляров и инициации воспалительной реакции с повышением проницаемости сосудистой стенки и развитием отека.

В результате ряда клинических исследований было показано, что диосмин снижает выраженность боли и отека у пациентов с ХВН благодаря улучшению лимфатического дренажа и микроциркуляции. Также он повышает резистентность и тонус сосудистой стенки, эластичность вен. Снижает капиллярную фильтрацию и гиперпроницаемость сосудов.

Противовоспалительный эффект дио­смина реализуется за счет подавления синтеза провоспалительных цитокинов путем блокирования транскрипционного фактора NF-κB и редукции рецепторов Т-клеток. Вследствие этого проявления ХВН (отек, боль, чувство тяжести и скованности в нижних конечностях) регрессируют, а качество жизни улучшается.

Значительное ослабление симптомов ХВН на фоне приема диосмина может быть также связано и с его антиоксидантной активностью, поскольку свободные радикалы оказывают повреждающее действие на клетку с последующим высвобождением медиаторов воспаления и развитием оксидативного стресса. Последний, в свою очередь, играет очень важную роль в патофизиологии многих нарушений в человеческом организме, а простагландины и их изомеры – ​изопростаны рассматриваются как биомаркеры оксидативного стресса. Так, например, повышенный уровень изопростанов отмечается у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Изопростаны, прежде всего F2-изопростаны (F2-isoP), а также изофураны являются основным продуктом неферментативного перекисного окисления липидов (ПОЛ) – ​полиненасыщенных жирных кислот клеточной мембраны. И если циркулирующие в крови изопростаны через некоторое время выводятся из организма с мочой, то промежуточные продукты их синтеза еще долго обнаруживаются в сосудистом русле. К ним относятся четыре региоизомерных ряда F2-IsoP – ​5-, 8-, 12- и 15-F2-IsoP, а также iPF2α-VI, iPF2α-IV, iPF2α-V и iPF2α-III соответственно. Также следует учитывать, что изопростан F2 может быть синтезирован в организме не только из арахидоновой кислоты, но и быть продуктом ПОЛ эйкозапентаеновой или докозагексановой кислот.

Поскольку определение уровней F2-IsoP и их метаболитов может быть полезно для оценки эффективности клинических методов лечения, направленных на снижение оксидативного стресса и воспаления, целью исследования было выявить влияние терапии диосмином на уровень изопростанов (8- изо‑15 (R) -PGF2α; 8-изо-PGF2α; 11β-PGF2α; 15 (R) -PGF2α) у пациентов с ХВН.

Исследование

Реактивы

Стандартизированные изопростаны, включая 8-iso-prostaglandin F (8-iso-PGF, 8-isoP), 8-iso‑15(R)-prostaglandin F, (8-iso‑15(R)-PGF, 8,15-isoP), 11β-prostaglandin F (11β-PGF, 11-isoP), 15(R)-prostaglandin F (15(R)-PGF, 15-isoP) и дейтерированные внутренние стандарты 8-iso-prostaglandin F – ​d4 (8-iso-PGF -d4, I.S.) были закуплены у SPI-BIO (Montigny le Bretonneux, Франция). Ацетонитрил для HPLC-MS был приобретен у Sigma-Aldrich (Польша). Муравьиная и соляная кислоты, а также этилацетат были куплены у P.O.Ch (г. Гливице, Польша). Ультрачистая вода заготавливалась при помощи системы HPLC (Hydrolab, Польша).

Выборка пациентов

Пациенты были отобраны в период с апреля 2014 по февраль 2015 года в ­отделении сосудистой хирургии и ангиологии Медицинского университета Люблина (Польша). В исследовании приняли участие 47 человек (мужчин – ​57,4%, женщин – ​42,6%, средний возраст – ​61±10,4 года, из них курящих – ​29,8%). Исследование было одобрено Независимым этическим комитетом. Критерием включения было наличие ХВН 2-5 степени по классификации CEAP (варикозно расширенные вены – ​48,9%, отеки – ​36,2%, кожные изменения, обусловленные заболеванием вен, – ​10,6%, те же кожные изменения и зажившая язва – ​4,3%).

Наличие сопутствующей патологии у пациентов: гипертензия – ​44,7%, коронарная болезнь – ​6,4%, сахарный диабет – ​8,5%, инфаркт – ​4,3%. Получали сердечно-сосудистую терапию: β-блокаторами – ​10,6%, ацетилсалициловой кислотой – ​31,9%, статинами – ​10,6%; антидиабетическое лечение – ​8,5%. Ни один из пациентов как минимум за 3 мес до исследования не принимал вазоактивные препараты.

Подготовка образцов крови

Кровь у пациентов брали до начала терапии и через 3 мес после ее завершения. Больным был назначен диосмин в дозе 600 мг 2 р./день (препарат Флебодиа производства «Лаборатория Иннотек Интернасьйональ», Франция). Образцы крови собирали в центрифужных пробирках (Sarstedt Monovette EDTA KE, Германия), содержащих ЭДТА (1 мг/мл) и восстановленный глутатион (1 мг/мл). Сразу центрифугировали при 1500 об./мин в течение 10 мин при 4 °C (центрифуга Эппендорфа 5702). 890 мкл плазмы переносили в 2-миллиметровые пробирки Эппендорфа, которые содержали 100 мкл бутилированного гидрокситолуола (200 мкл/мл) для предотвращения окисления, и хранили при -80 °C для дальнейшего анализа.

Выделение изопростанов

К 400 мкл размороженной плазмы было добавлено 4 мл воды, подкисленной соляной кислотой (pH2) и 4 мл этилацетата. Для достижения конечной концентрации 100 пг/мл перед экстракцие дополнительно использовался дейтерированный внутренний стандарт, 8-isoP-d4. Полученную смесь встряхивали в течение 10 мин и центрифугировали 4 мин при 4400 об./ мин. Верхний органический слой дважды собирали и экстрагировали этилацетатом. Затем 8  мл забранного органического слоя выпаривали под слабой струей азота. Сухой остаток повторно растворяли в 400 мкл подвижной фазы и использовали для дальнейшего анализа LC/MS.

Анализ LC/MS

В исследовании была использована система LC-MS8050 Shimadzu, состоящая из двоичного насоса (NEXERA X2 LC‑30 AC), термостата (CTO‑20AC PROMINENCE COLUMN OVEN), автосамплера (NEXERA X2 SIL‑30AC) и тройного квадрупольного ­масс-спектрометра (Shimadzu, Япония), оборудованного источником ESI, работающим в режиме отрицательных ионов. Для всех анализов использовалась колонка C18 Kinetex, Phenomenex (150×2,1 мм; 2,6 мкм) при поддерживаемой температуре 50 °C.

В качестве подвижных фаз применялись растворы 0,015% муравьиной кислоты в воде (раствор «А») и 0,01% муравьиной кислоты в ацетонитриле ­(раствор «В»). ­Использованный градиент: 15% раствора «В» сохраняли в течение 1 мин, затем линейный градиент от 15 до 100% раствора «В» в течение 7 мин. Поток составлял 0,7 мл/ мин, а объем инъекции – ​50 мкл. Для сбора данных использовался множественный мониторинг реакции. Количественная оценка проводилась с применением нескольких реакций мониторинга m/z 353,10 → 193,10 для всех изопростанов и 357,20 → 197,10 для 8-iso-простагландина F-d4, при сборе и анализе данных использовалось программное обеспечение LabSolutions 5.60 SP1.

Статистический анализ

Статистический анализ результатов (программное обеспечение Statistica 10, StatSoft Polska Sp. z o.o.) проводился с использованием метода описательной статистики со следующими параметрами: размер группы; среднее арифметическое; среднее, минимальное и максимальное значение переменных; стандартное отклонение и средняя стандартная ошибка. Оценка значимости различий между курящими и некурящими проводилась на основании U-критерия теста Манна-Уитни.

Результаты и их обсуждение

Определение уровня F2-изопростана позволяет оценить выраженность оксидативного стресса in vivo и указывает на его роль в патогенезе различных заболеваний. Некоторые литературные данные свидетельствуют о связи между концентрацией изопростанов в крови или моче с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Так, их повышенный уровень по сравнению с контрольной группой отмечается у пациентов с гипертрофической кардиомиопатией (35,4 против 29,9 пг/мл соответственно) и атеросклеротическими поражениями (75,9 и 11,7  пг/мг соответственно).

Диосмин, как и большинство флавоноидов, обладает способностью связывать свободные радикалы и, следовательно, должен снижать концентрацию маркеров оксидативного стресса, таких как изопростаны. Поэтому целью данного исследования было оценить влияние 3-месячного лечения диосмином (2×600 мг) на уровень изопростана у пациентов с ХВН. Для этого определялись значения 4 соединений: 8-изо‑15 (R) -PGF2α, 8-изо-PGF2α, 11β-PGF2α и 15 (R) -PGF2α.

В целом была отмечена высокая вариативность уровней изопростана в исследуемой группе как до начала лечения (Т0), так и после его завершения спустя 3 мес (Т3m). Диапазон значений в точке Т0 составил 0,1-153,8 пг/мл (медиана 24,7 пг/ мл) и в точке Т3m-0,1-118,1 пг/мл ­(медиана 12,7  пг/мл) ­соответственно. Среднее значение T0­составило 39,65±42,1, ­уменьшившись в точке Т3m до 23,97±31,3  пг/ мл, что является статистически значимой разницей (рис. 1).

Наиболее выраженные изменения были отмечены для изомеров: 11β-PGF2α и 15 (R) -PGF2. Также была проведена оценка и других показателей, ассоциированных с повышенным риском ХВН (общий холестерин, липопротеины высокой плотности, липопротеины низкой плотности, фракция триглицеридов и индекс массы тела – ​ИМТ) до и после терапии диосмином, однако их уровни остались неизменными.

В ходе анализа данных отдельных участников исследованиях у 25 было отмечено статистически значимое снижение изопростана. У 12 больных изменения были незначительными, а у 7 их уровень, напротив, повысился до 35 пг/мл. У 3  пациентов был обнаружен аномальный уровень маркера (>93 пг/мл). Однако, вероятнее всего, это была манифестация коморбидного состояния, ассоциированного с оксидативным стрессом.

Из исследуемой группы 14 пациентов были курильщиками, поэтому у них ­ожидался более высокий, по сравнению с некурящими, уровень изопростанов в крови, поскольку в многочисленных ­исследованиях было показано, что табачный дым способствует развитию оксидативного стресса за счет образования свободных радикалов и подавления активности антиоксидантов.

По данным разных авторов, уровень свободных и эстерифицированных F2-изопростанов в плазме у курильщиков в 2 раза выше, чем у некурящих, при этом двухнедельный отказ от курения значительно снижает их содержание в крови. Удивительно, но в нашем исследовании разница в обеих исследуемых группах до лечения диосмином не была статистически значимой: среднее содержание маркеров оксидативного стресса у курильщиков и некурящих составляло 42,96±40,3 и 38,25±43,3 пг/мл соответственно.

Также в обеих группах отсутствовали значимые отличия по уровню холестерина в крови и ИМТ. Тем не менее доля пациентов с чрезвычайно высоким уровнем изопростанов (>50 пг/мл) была выше среди курильщиков по сравнению с некурящими (35,7 и 24,2% соответственно). Спустя 3 мес терапии ­Флебодией концентрация ­ изопростанов в крови у курильщиков значительно уменьшилась (7,74±9,9 пг/мл). У некурящих, в свою очередь, не было отмечено статистически значимых изменений (рис. 2). Способность к снижению уровня оксидативного стресса, спровоцированного никотином, была доказана in vivo и у других флавоноидов, таких как силимарин и нарингенин, а также у антиоксиданта – ​витамина Е.

Необходимо отметить, что описываемое исследование имеет несколько ограничений, причем наиболее важным является относительно небольшое число пациентов и гетерогенность с точки зрения сопутствующих заболеваний (сахарный диабет, ишемическая болезнь сердца и артериальная гипертензия). Таким образом, влияние коморбидной патологии на окончательные результаты исследования оценить было сложно, но статистически значимых отличий в уровнях изопростанов между больными с коморбидными патологиями и без таковых обнаружено не было. ­Сильной стороной исследования является тот факт, что все пациенты получали терапию диосмином в соответствии с протоколом, а все полученные результаты были статистически обработаны.

Выводы

В исследовании было изучено изменение уровня изопростанов у больных с ХВН на фоне 3-месячной терапии диосмином. В основной группе наблюдалось статистически значимое снижение концентрации изопростанов в сыворотке крови. Среднее значение в первичной точке составило 39,65±42,1, а через 3 мес уменьшилось до 23,97±31,3 пг/мл. Наиболее значимые изменения наблюдались у курящих пациентов, уровень изопростанов у них снизился с 42,96 до 7,74 пг/мл. Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод о том, что диосмин обладает способностью к снижению оксидативного стресса и может быть с успехом использован в этой когорте пациентов.

Подготовила Ирина Чумак

Тематичний номер «Хірургія, Ортопедія, Травматологія, Інтенсивна терапія» № 3 (33), вересень 2018 р.

СТАТТІ ЗА ТЕМОЮ Хірургія, ортопедія та анестезіологія

18.03.2019 Хірургія, ортопедія та анестезіологія Пересмотр принципов назначения тайгециклина

Тайгециклин, первый представитель антибиотиков (АБ) группы глицилциклинов, был одобрен Европейским агентством лекарственных средств (European Medicine Agency, ЕМА, 2014) для лечения осложненных инфекций кожи и мягких тканей (оИКМТ) и осложненных интраабдоминальных инфекций (оИАИ). Тайгециклин обладает широким спектром активности против грамположительных и грамотрицательных бактерий, включая анаэробы. Препарат отличается своеобразным механизмом действия, который состоит в подавлении синтеза бактериальных белков путем связывания с 30S-субъединицей рибосом....

07.11.2018 Хірургія, ортопедія та анестезіологія Прощальное слово

Безвременно, вследствие обострившегося недуга, ушел из жизни один из создателей и директор Украинского научно-практического центра эндокринной хирургии, трансплантации органов и тканей Мин­здрава Украины Александр Сергеевич Ларин. ...

06.11.2018 Хірургія, ортопедія та анестезіологія Эффективное лечение трофических нарушений нижних конечностей: новый взгляд на пентоксифиллин

Пентоксифиллин – ​препарат с длительной историей применения и высокой терапевтической эффективностью в лечении заболеваний, связанных с нарушением периферического кровообращения. Благодаря своей безопасности и хорошей переносимости, а также протекторному действию на сердечно-сосудистую систему он очень популярен у врачей различных специальностей....

06.11.2018 Хірургія, ортопедія та анестезіологія Современный взгляд на вопросы периоперационного обезболивания

Болевой синдром остается основной жалобой пациентов хирургического профиля как в до-, так и в послеоперационный период. Причем во втором случае проблема явно преобладает (до 80%, по различным данным), поэтому ее предупреждение и контроль являются неотъемлемыми компонентами периоперационного ведения больных. ...