0 %

Молекулярно-генетическая диагностика синдрома Жильбера

03.03.2019

Впервые этот синдром был описан французским врачом A. Gilbert в начале XX века [1]. Частота встречаемости СЖ в европеоидной, негроидной и монголоидной расах составляет 5-10, 30-35 и 2-3% соответственно [2, 3]. По статистическим данным, указанная патология чаще проявляется у мужчин (12,4%), чем у женщин (4,8%; соотношение 3:1-4:1). Средняя концентрация билирубина при СЖ значительно выше у мужчин, что может быть связано с ингибированием андрогенными стероидами процесса ферментативного глюкуронирования билирубина. СЖ передается по аутосомно-рецессивному типу наследования и, как правило, манифестация наблюдается в возрасте до 30 лет. Основным клиническим проявлением СЖ является желтушное окрашивание кожи, склер, слизистых. Во время эпизодов желтухи отмечаются боль в животе, спазмы в желудке, вздутие живота, диарея или запор, чувство усталости, потеря аппетита, головокружение, депрессия, потливость. У пациентов возможна манифестация с развитием токсических реакций при приеме некоторых лекарственных препаратов: анаболических стероидов, глюкокортикоидов, андрогенов, рифампицина, циметидина, хлорамфеникола, стрептомицина, салицилата натрия, ампициллина, кофеина, этинилэстрадиола, парацетамола, иринотекана.

Источники билирубина

У здорового человека в сутки распадается около 1% циркулирующих эритроцитов. Освободившийся при этом гемоглобин в клетках ретикулоэндотелиальной системы (костный мозг, селезенка) распадается на гем (небелковую железосодержащую часть, в молекуле которой железо связано с протопорфирином) и белковое со­единение – глобин. Основная часть билирубина (80-85%) синтезируется в печени, а около 15-20% поступает из других источников, таких как гемопротеины (миоглобин, цитохромы, каталаза, пероксидаза) и незрелые клетки (эритробласты, незрелые ретикулоциты). В организме человека образуется 250-350 мг билирубина ежедневно.

Ферментативный механизм образования билирубина

После распада гемоглобина в ретикулоэндотелиальной системе, образования гема и глобина происходит окисление гема под действием гемоксигеназы. В этой реакции расходуется три молекулы кислорода и никотинадениндинуклеотидфосфат с образованием эквивалентного количества биливердина и оксида углерода. В дальнейшем биливердин под действием биливердинредуктазы конвертируется в билирубин. Образовавшийся билирубин (неконъюгированный, непрямой, свободный) является гидрофобным, липофильным соединением, не способным к почечной и билиарной секреции. Даже умеренно повышенный уровень свободного билирубина является токсичным для центральной нервной системы, что проявляется невыраженными клиническими симптомами (ослабление внимания, утомляемость и др). Билирубин имеет высокое сродство к альбумину, поэтому 99% неконъюгированного билирубина циркулирует в плазме в виде комплекса с этими белками. Неконъюгированный билирубин, связанный с альбумином, транспортируется в печень, где происходит диссоциация этого комплекса. В гепатоцитах непрямой билирубин отщепляется от альбумина и взаимодействует с глюкуроновой кислотой при участии фермента уридиндифосфатглюкуронозилтрансферазы (UGT1A1), образуя при этом глюкуронид билирубина (моноглюкуронид – 15% и диглюкуронид – 85%) или конъюгированный (прямой) билирубин (рис. 1).

У большинства пациентов с СЖ гипербилирубинемия проявляется в молодом возрасте. В зависимости от референтных интервалов, установленных в лабораториях, верхний предел для общего билирубина в норме – от 17 до 20 мкмоль/л, из которых 75% приходится на неконъюгированный билирубин [4]. При СЖ ­концентрация общего билирубина составляет от 20 до 50 мкмоль/л и редко превышает 85 мкмоль/л.

Несмотря на развитие новых медицинских технологий, диагностика СЖ до сих пор остается достаточно сложной. При наличии огромного количества лабораторных (неконъюгированный билирубин, общий анализ крови с ретикулоцитами, ферменты печени) и функциональных (гипокалорийный, с никотиновой кислотой, с фенобарбиталом) тестов не выработан оптимальный алгоритм применения, основанный на их чувствительности и специфичности. В связи с этим рекомендуется проведение генетического анализа для подтверждения СЖ.

Клиническая картина СЖ обусловлена снижением до 30% уровня функциональной активности UGT1A1 – фермента, необходимого для конъюгирования билирубина. Этот фермент кодируется геном UGT1A, расположенным на 2q37 хромосоме.

Ген UGT1A

В 1991 г. J. Ritter и соавт. сообщили о выделении из печени двух клонов, кодирующих ДНК – UGT1A и UGT1D (переименованные в дальнейшем в UGT1A и UGT1A4), с билирубиновой глюкуронилтрансферазной активностью [5]. Нуклеотидная последовательность из 30 регионов этих двух клонов была одинаковой (кодируются одним геном), что и подтвердилось спустя год, когда авторы сообщили о выделении большого участка гена UGT1A с его уникальной структурой [6]. В начале 2000-х гг. был полностью изучен принцип работы гена UGT1A: имеет длину 218 kb и содержит 13 аминотерминальных экзонов, которые кодируют субстрат, связывающий домен и 4 общих карбокситерминальных экзонов, кодирующих УДФ-глюкуроновую кислоту [7].

Вариабельные экзоны 1A2-1A13 не участвуют в метаболизме билирубина. Генетические мутации, связанные с отсутствием или снижением ферментативной активности, которые вызывают нарушения конъюгирования билирубина, локализованы в вариабельных экзонах 1А1 и общих экзонах с 2-го по 5-й (рис. 2).

UGT1A1

Ген UGT1A1 кодирует фермент UGT1A1. В печени последний катализирует реакцию соединения (конъюгирования) билирубина (непрямой, неконъюгированный) с глюкуроновой кислотой. СЖ обусловлен мутацией в гене UGT1A. Активность UGT1A1 у пациентов с этим синдромом составляет около 30% от нормы, основанной на исследованиях с использованием образцов печени человека [8, 9]. В настоящее время семейство ферментов UGT1A1 продолжают активно изучать. Изоформы UGT1A обнаружены в различных отделах организма человека: в печени – UGT 1А1, 1А3, 1А4, 1А6, 1А9, 1А7, в пищеводе и желудке – UGT 1А8, в кишечнике – UGT1А10. Функцией ферментов семейства UGT 1А1 является конъюгация как эндогенных метаболитов, гормонов, нейротрансмиттеров, так и экзогенных веществ (различных ксенобиотиков, канцерогенов, лекарственных препаратов) [10, 11]. Белки семейства UGT человека (ЕС 2.4.1.17) имеют средний молекулярный вес приблизительно 56 кДа; в их состав входит около 530 аминокислот. UGT являются интегральными мембранными белками эндоплазматического ретикулума, состоящими из 2 аналогичных по размеру доменов (рис. 3).

Полиморфизм UGT1A1

У человека подсемейства UGT1 и UGT2 содержат 19 различных изоферментов, имеющих близкую последовательность аминокислот [12, 13]. Однако только UGT1A1 способна глюкуронировать билирубин [14]. В 1995 г. было показано, что мутация в промоторном участке гена UGT1A1 является необходимой, но недостаточной для полной манифестации СЖ. Эта мутация, снижающая активность фермента UGT1A1, представляет собой вставку двух нуклеотидов в ТАТА-боксе промотора гена. В этом случае нормальная последовательность A(TA)6TAA трансформируется в последовательность A(TA)7TAA. Шесть повторов тимин-аденин (TA) в области промотора A(TA)6TAA соответствуют нормальной функциональной активности фермента UGT. При вставке седьмого ТА-повтора A(TA)7TAA ухудшается связывание с транскрипционным фактором, в результате чего уменьшается экспрессия гена, что ведет к снижению функциональной активности фермента, которая проявляется непрямой (неконъю­гированной) гипербилирубинемией. При наличии вставки TA в гомозиготном состоянии наблюдается снижение активности фермента на 30% и конъюгации билирубина в гепатоцитах на 80% по отношению к норме. Тенденция к прогрессирующему снижению активности фермента также отмечается при увеличении TA-повторов (например, до 8). В случае возрастания числа ТА-повторов до 8 в одном из аллельных генов или в обоих СЖ также считается подтвержденным – А(ТА)7 ТАА / А(ТА)8ТАА и А(ТА)8 ТАА / А(ТА)8ТАА. Активность фермента UGT1A1 находится в обратной зависимости от количества повторов.

К настоящему времени для UGT1A1 показано существование не менее 4 аллелей: A(TA)6TAA (рис. 4).

  1. UGT1A1*1 – «дикий тип», wild type;
  2. UGT1A1*28 – аллель A(TA)7TAA, наиболее частый мутантный;
  3. UGT1A1*36 – аллель (TA)5;
  4. UGT1A1*37 – аллель (TA)8.

Частота мутантного аллеля UGT1A1*28 в ­различных популяциях следующая: 26-39% – для европеоидной, 9-33% – для азиатской, 40-56% – для негроидной ­популяции. Другие мутантные аллели – UGT1A1*36 и UGT1A1*37 – обнаружены главным образом в негроидной популяции с частотой 2-16%.

Идентификация количества ТА-повторов в промоторной области гена UGT1A1

Самым быстрым и эффективным методом для выявления СЖ является ДНК-диагностика с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), который заключается в определении числа TA-повторов в гене UGT1A1.

Метод ПЦР с использованием капиллярного гель-электрофореза

Молекулярно-генетическая диагностика проводится методом ПЦР с меченными карбоксифлуоресцеином праймерами с разделением продуктов амплификации при помощи капиллярного гель-электрофореза.

Ампликон длиной 96 пар основ соответствует участку промотора гена UGT1A1 с 7 ТА-повторами, что поз­воляет подтвердить диагноз СЖ. Ампликон длиной 94 пары основ соответствует нормальному участку промотора гена UGT1A1 с 6 ТА-повторами. Наличие двух ампликонов длиной 96 и 94 пары основ свидетельствует о гетерозиготном носительстве 6/7 ТА-повторов.

Секвенирование продуктов ПЦР

На рисунке 5 представлен фрагмент нуклеотидной последовательности UGT1A1 для нормального гомозиготного генотипа 6/6 (структура повтора: A-(TA)6-TAA, результат секвенирования продукта ПЦР размером 97 пар нуклеотидов) и фрагмент нуклеотидной последовательности UGT1A1 для мутантного гомозиготного генотипа 7/7 (структура повтора: A-(TA)7-TAA, ­результат секвенирования продукта ПЦР размером 99 пар нуклеотидов).

Интерпретация результатов исследования

Варианты молекулярно-генетического анализа могу быть следующими (рис. 6):

  1. UGT1A1 (ТА)6/(ТА)6 – нормальный («дикий») генотип. CЖ не выявлен.
  2. UGT1A1 (ТА)6/(ТА)7 – генотип с увеличением ТА-повторов в гене в гетерозиготном состоянии. Риск развития СЖ – в латентной или легкой форме.
  3. UGT1A1 (ТА)7/(ТА)7 – генотип с увеличением ТА-повторов в гене в гомозиготном состоянии. Очень большой риск развития СЖ. Заболевание может протекать со значительным повышением уровня билирубина и тяжелыми клиническими проявлениями.

Выводы

В настоящее время все большее значение приобретает необходимость лабораторного подтверждения СЖ, что связано с установлением дифференциального диа­гноза. При выявлении повышенного уровня билирубина в сыворотке крови в течение продолжительного времени рекомендуется прежде всего выполнить молекулярно-генетический анализ. Назначение исследования ТА-повторов в гене UGT1A важно в следующих случаях: при дифференциальной диагностике СЖ и других заболеваний, сопровождающихся гипербилирубинемией, перед началом лечения с использованием лекарственных препаратов, обладающих гепатотоксическим действием, при возможности осложнений терапии иринотеканом, слабовыраженной неинфекционной желтухе, отягощенном семейном анамнезе и др. Необходимость назначения молекулярно-генетического анализа и интерпретации полученных результатов определяется врачом-генетиком при проведении медико-генетического консультирования.

В Украине анализ для определения ТА-повторов в промоторной области гена UGT1A1, ответственного за развитие СЖ, возможно сделать в некоторых частных медицинских лабораториях.

Список литературы находится в редакции.

Медична газета «Здоров’я України 21 сторіччя» № 24 (445), грудень 2018 р.

СТАТТІ ЗА ТЕМОЮ Терапія та сімейна медицина

06.05.2019 Терапія та сімейна медицина Больные сахарным диабетом должны иметь возможность видеть: в центре внимания – Трайкор® 145 мг

По материалам научно-практической конференции с международным участием Ophthalmic Hub 2019, 15-16 марта, г. Киев...

06.05.2019 Терапія та сімейна медицина Перспективні лікарські засоби рослинного походження в гінекології при нейроендокринних синдромах

Усі захворювання гінекологічного профілю поділяються на 3 групи: до першої належать ті, що пов’язані з розвитком інфекції в організмі жінки; друга група включає патологію ендокринної системи і порушення гормонального фону; до третьої відносять патологічні стани, що супроводжуються розвитком гіперпластичних або дистрофічних змін, та пухлинні процеси. Використання лікарських рослин може бути корисним при лікуванні багатьох гінекологічних захворювань. ...

06.05.2019 Терапія та сімейна медицина Ліки без шкоди: менеджмент ризиків взаємодії лікарських засобів у пацієнтів з артеріальною гіпертензією

Всесвітня організація охорони здоров’я (ВООЗ) у 2017 р. розпочала кампанію «Ліки без шкоди» (Medication without harm), що має на меті упродовж 5 років удвічі зменшити смертність від ятрогенних медикаментозних впливів. У рамках цього проекту міністрам охорони здоров’я рекомендується ініціювати створення національних планів, що включатимуть, зокрема, системи та практики управління лікарськими засобами (ЛЗ) [36]....

06.05.2019 Терапія та сімейна медицина Кашель у дітей: алгоритм дій сімейного лікаря

26 лютого в Харкові відбулася науково-практична конференція «Актуальні питання алергології та пульмонології в практиці сімейного лікаря», під час якої були докладно розглянуті аспекти надання медичної допомоги пацієнтам з респіраторною патологією лікарями первинної ланки охорони здоров’я. ...