Актуальные вопросы цитологической диагностики опухолей в Украине

1 декабря 2014 года в г. Киеве состоялся научно-практический семинар «Актуальные вопросы цитологической диагностики опухолей». Для совместного обсуждения результатов научных исследований и актуальных вопросов, касающихся деятельности цитологической службы, собрались руководители и сотрудники двух крупнейших учреждений Украины, занимающихся проблемами онкологии и цитологи из многих регионов Украины. Объединенный форум Национального института рака (НИР, г. Киев) и Института экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины (ИЭПОР, г. Киев) был посвящен 115-летию со дня рождения выдающегося украинского ученого, академика Ростислава Евгеньевича Кавецкого.

Во вступительном слове с позиций директора НИР доктор медицинских наук, профессор Игорь Борисович Щепотин отметил роль выдающегося украинского ученого Р.Е. Кавецкого как создателя мощной научной школы и учителя для нескольких поколений исследователей. Большую часть своей жизни Ростислав Евгеньевич посвятил институту, который сегодня носит его имя и является крупнейшим в Украине научно-исследовательским институтом в сфере онкологии. Профессор И.Б. Щепотин также акцентировал внимание на значимости введения специальности «врач-цитолог», которая сегодня не входит в классификатор медицинских профессий, несмотря на приложенные многочисленные усилия сотрудников института. Он пожелал коллегам плодотворной работы и подчеркнул центральную роль цитологов в диагностике онкологических заболеваний, ведь сегодня без соответствующего исследования невозможно поставить диагноз и назначить адекватную терапию. Кроме того, профессор обратился к присутствующим с предложением подготовить официальное обращение в Министерство здравоохранения Украины от коллективов двух институтов с просьбой ввести специальность «врач-цитолог».

С докладом «Р.Е. Кавецкий и логистика цитологических исследований в Украине» выступил директор ИЭПОР, академик НАН Украины, доктор медицинских наук, профессор Василий Федорович Чехун. Докладчик подчеркнул, что в современных условиях приобретают особую значимость укрепление научного сотрудничества между украинскими профильными учреждениями, поиск новых нестандартных решений для развития науки и медицины. Это будет достойным продолжением традиций, заложенных первым директором института Р.Е. Кавецким, новаторство которого широко известно. Еще в 1960 г. под руководством Ростислава Евгеньевича начал действовать НИИ экспериментальной и клинической онкологии (нынешний ИЭПОР), который в 1971 г. приобрел академический статус. По словам академика В.Ф. Чехуна, работы Р.Е. Кавецкого и сотрудников возглавляемого им института существенно повлияли на развитие цитологической диагностики злокачественных новообразований. В 1977 г. по инициативе Р.Е. Кавецкого в институте прошел международный симпозиум, на котором рассматривалась роль стволовых клеток кроветворения в канцерогенезе, а в 1978 г. – советско-французский симпозиум, посвященный вопросам ультраструктуры и гистохимии нормальных и опухолевых клеток.
Еще молодым ученым под руководством академика Александра Александровича Богомольца Р.Е. Кавецкий изучал роль нервных и эндокринных факторов в патогенезе злокачественных опухолей; благодаря плодотворному тандему учителя и ученика было положено начало изучению сложных механизмов взаимоотношения опухоли и организма. Р.Е. Кавецкий утверждал, что в основе канцерогенеза лежат два взаимосвязанных процесса: возникновение местного опухолевого зачатка, а также целостные изменения организма (опухолевая диспозиция).

Цитологические исследования опухолей в Украине начинают проводиться с 1948 г. на базе Киевского рентген-радиологического и онкологического института (нынешний НИР). История их развития связана с такими именами, как А.В. Руденко, которая проводила цитологические исследования при диагностике патологии шейки матки; Л.К. Куница, впервые в мировой практике определившая и описавшая цитоморфологические признаки мелкоклеточного рака легкого; А.Н. Мельник и В.И. Лобода, посвятившие свою деятельность цитологической диагностике опухолей разного генеза. Сегодня данное направление исследований в НИР возглавляет профессор Л.С. Болгова. В ИЭПОР наиболее весомый вклад в развитие клинической цитологии внесли академик НАН Украины В.Г. Пинчук, основатель школы, занимавшейся изучением ультраструктурных особенностей опухолевых клеток; академик НАН Украины З.А. Бутенко, посвятившая свои работы исследованию молекулярных механизмов канцерогенеза, изучению опухолевых стволовых клеток; профессор А.И. Быкорез, изучавший цитоморфологию экспериментальных опухолей; профессор Д.Ф. Глузман, чьи работы имеют большое значение для развития цитологических и иммуноцитологических исследований при ранней и дифференциальной диагностике гемобластозов, для классификации последних. Высоко отмечен вклад основателя научной школы «Генетика рака» профессора К.П. Ганиной, ученики которой являются сотрудниками ИЭПОР и занимаются изучением цитологии, цитохимии, цитологической реактивности, цитогенетики опухолей кожи и женской репродуктивной системы. Сегодня ученые ИЭПОР уделяют большое внимание дальнейшему изучению цитологических маркеров злокачественности опухолей и их молекулярного профиля. Эти исследования помогают уточнить диагностику опухолей, а также ответить на ряд важных вопросов, касающихся клинической практики, включая определение чувствительности к неоадъювантной химио- и гормональной терапии, а также прогноза течения заболевания.

Заведующий отделом иммуноцитохимии и онкогематологии ИЭПОР, доктор медицинских наук, профессор Даниил Фишелевич Глузман посвятил выступление особенностям новой классификации опухолей из зрелых Т-, В- и ЕК-клеток. Докладчик напомнил, что неходжкинские лимфомы (НХЛ) представляют собой гетерогенную группу опухолей, возникающую из различных типов клеток лимфоидной ткани. В структуре общей заболеваемости злокачественными новообразованиями НХЛ занимают 5-е место. Они диагностируются на основе цитологического и иммуногистохимического изучения материала, полученного путем эксцизионной биопсии лимфатического узла или материала из экстранодальных очагов поражения (при их наличии). Исследование окрашенных препаратов позволяет определить характер роста, провести дифференциальную диагностику между воспалительными, диспластическими изменениями, метастазами низкодифференцированных опухолей и другими патологическими процессами. При выделении отдельных форм и вариантов лимфом крайне важным является цитологическое исследование отпечатков и биоптатов удаленных лимфоузлов. Используется иммуногистохимическое исследование с использованием широкого спектра антител, а также методов молекулярно-генетического анализа.
Докладчик рассмотрел ключевые этапы классификации лимфоидных новообразований и отметил, что предпосылками для появления современной классификации НХЛ стало открытие Т- и В-лимфоцитов, определение при помощи гибридомных технологий большого спектра диагностических антител, изучение новых данных об иммуноморфологии опухолей лимфоидной ткани и др. Сегодня используется классификация НХЛ Всемирной организации здравоохранения 4-го пересмотра (2008); в настоящее время разрабатывается новая классификация лимфом.
Специалистами отдела иммуноцитохимии и онкогематологии ИЭПОР разработаны оригинальные диагностические тест-системы, в состав которых входят моноклональные антитела, используемые в диагностике лимфопролиферативных заболеваний. Докладчик рассмотрел особенности классификации и диагностики ряда лимфом из В-, Т- и ЕК-клеток, подчеркнул специфические особенности, которые необходимо учитывать в диагностическом процессе, а также рассказал о результатах научно-исследовательской работы, посвященной усовершенствованию диагностики НХЛ.

Заведующая научно-исследовательской лабораторией клинической цитологии НИР, доктор медицинских наук, профессор Людмила Севастьяновна Болгова рассмотрела в докладе современные возможности комплексного цитоморфологического исследования новообразований яичника. По уточненным данным, показатель заболеваемости раком яичника в 2012 г. в Украине составил 18,4 случая на 100 тыс. населения. Диагностика опухолей яичника остается одним из наиболее сложных вопросов онкоморфологии, что обусловлено чрезвычайной мозаичностью их гистологической структуры. В международной классификации новообразований яичника насчитывается 14 источников возникновения указанных опухолей, из которых развивается более 150 нозологических форм. Значение цитологического исследования при опухолях яичника трудно переоценить, так как в большинстве случаев его результаты являются единственным обоснованием для начала лечения. По результатам морфологических методов исследования определяют объем оперативного вмешательства и необходимость дальнейшего медикаментозного лечения. Данные цитологического исследования смывов с органов брюшной полости являются одними из важных составляющих критериев при стадировании опухолевого процесса во время операции.
В НИР изучалась частота встречаемости доброкачественных, злокачественных и пограничных новообразований яичника в зависимости от гистогенеза и возраста по результатам гистологических исследований операционного материала больных (n=677) с новообразованиями яичника, прооперированных в 2008-2011 гг. В структуре заболеваемости определили 55% случаев злокачественных опухолей, 42% доброкачественных и 3% пограничных.
Проведенные под руководством профессора Л.С. Болговой комплексные цитоморфологические исследования позволили выявить ряд особенностей новообразований яичников, дополнить известные морфологические данные, внести определенный вклад в развитие онкоморфологии. Осуществлялся поиск объективизированных цитологических признаков для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных форм новообразований яичников. В частности, изучались цитогенетические параметры по наличию и морфофункциональным типам ядрышковых организаторов в ядре опухолевых клеток. Установлено, что со снижением степени дифференцировки опухоли яичника в ядрах клеток увеличивается общее количество морфофункциональных типов ядрышковых организаторов, что на субклеточном уровне определяет пролиферативную активность опухоли в целом. Изучены количественные параметры по разработанной авторами схеме, которая включает 60 признаков и их градаций. Полученные результаты исследователи рекомендуют для практического применения в цитологических лабораториях.

От имени коллектива авторов научно-исследовательской лаборатории клинической цитологиии НИР выступила Светлана Вячеславовна Мариненко с докладом, посвященным дифференциальной цитологической диагностике пролиферирующего мезотелия, аденокарциномы и мезотелиомы. По ее словам, цитологическая диагностика изменений мезотелия позволяет установить характер процесса, а также первичное или вторичное поражение серозных оболочек. Накопление жидкости в серозных областях при неопухолевых и опухолевых процессах встречается, соответственно, в 15 и 85% случаев. Неопластический процесс может представлять собой первичное поражение серозных оболочек (мезотелиома) и вторичное (метастатическое).
На базе лаборатории цитологической диагностики НИР было проведено исследование, направленное на выявление дополнительных признаков дифференциальной диагностики злокачественной мезотелиомы, аденокарциномы и реактивного мезотелия при помощи иммуноцитохимического и цитогенетического методов исследования. В результате получен ряд интересных данных. Так, при злокачественной мезотелиоме в мазках отсутствуют клетки «чужой» популяции, тогда как при аденокарциноме подобные популяции присутствуют. При реактивной пролиферации мезотелия группы обычно состоят из небольшого количества мелких клеток, в отличие от скоплений или комплексов из клеток больших размеров при мезотелиоме или раке. Цитоплазма клеток мезотелия за счет микроворсинок на периферии имеет «кружевной» край, что более выражено у мезотелиомы. Для реактивного мезотелия характерно преобладание в цитограмме монослойно лежащих однотипных клеток, в отличие от популяций мономорфно-атипичных клеток при мезотелиоме. Границы скоплений мономорфно-атипичных клеток при мезотелиоме имеют неровный, бугристый край, в отличие от комплексов клеток при аденокарциноме, для которых характерны ровные контуры. При дифференциальной диагностике мезотелиомы и аденокарциномы, а также реактивного мезотелия и аденокарциномы более эффективно применение иммуноцитохимического метода. При дифференциальной диагностике реактивного мезотелия и мезотелиомы преимущественно применяется подсчет основных типов ядрышек в аргентумпозитивных опухолевых клетках. Для клеток мезотелиомы характерны положительная иммуноцитохимическая реакция на калретинин, виментин, цитокератин 5/6 и отрицательная реакция на Ber-EP4, CEA, Pan CK; для метастазов аденокарциномы установлена противоположная закономерность. При сравнительном исследовании показателей основных морфофункциональных типов ядрышек в материале мезотелиомы выявлено более высокое абсолютное и процентное содержание активных ядрышек по сравнению с таковыми показателями реактивного мезотелия.

С докладом, в котором были рассмотрены ошибки в клинической цитологии, их причины и пути преодоления, от имени коллектива авторов научно-исследовательской лаборатории клинической цитологии НИР выступила Татьяна Михайловна Ярощук. Она напомнила, что цитологическое исследование применяют:
– у всех больных при наличии опухолевидных образований, инфильтратов, язв, эрозий, патологических выделений, выпотных жидкостей, кист и т.д.;
– во время хирургического вмешательства по поводу злокачественных новообразований (срочная диагностика) для установления степени распространенности процесса и определения объема операции;
– при динамическом наблюдении за больными с выявленными предраковыми состояниями;
– при профилактических осмотрах с целью выявления предопухолевых состояний и опухолей.
Роль и место цитологического метода определяются возможностями клинической цитологии в установлении морфологического характера патологического процесса. Как известно, морфологическая верификация (цитологическая и/или гистологическая) диагноза злокачественного новообразования до начала лечения является неотъемлемым правилом онкологической диагностики. Уверенное цитологическое заключение о наличии злокачественного новообразования, совпадающее с клиническими симптомами и данными других диагностических исследований, следует расценивать как морфологическое подтверждение диагноза злокачественной опухоли. Отрицательный результат цитологического исследования при наличии убедительных клинических данных не доказывает отсутствие опухоли. Критериями достоверности цитологических заключений являются данные гистологического исследования операционного или биопсийного материала, а также ближайшие и отдаленные результаты лечения. В зависимости от характера ошибок выделяют ложноположительные и ложноотрицательные заключения цитологического исследования (гипер- и гиподиагностика), ошибочное цитологическое заключение по генезу или гистологической форме опухоли. Среди ошибок диагностики выделяют объективные (при отсутствии патогномонических критериев злокачественности клеток или методов уточняющей диагностики), субъективные (при игнорировании современных цитологических классификаций, низкой квалификации цитолога и/или врача-клинициста), а также технические (при взятии образца, изготовлении препарата, обработке и покраске материала). Установлено, что в общей структуре ошибок цитологической диагностики 17,2% занимают объективные ошибки, 20,3% – субъективные и 62,5% – технические. Таким образом, в фокусе внимания сегодня минимизация технических ошибок. В качестве перспективного метода рассматривается автоматизация изготовления цитологических препаратов (например, метод жидкостной цитологии). Не случайно во время конференции звучало также обсуждение современных возможностей и преимуществ жидкостной цитологии.

В докладе кандидата биологических наук Анны Владимировны Зелинской (лаборатория морфологии эндокринной системы Института эндокринологии и обмена веществ им. В.П. Комиссаренко НАМН Украины, г. Киев) рассмотрены особенности иммуноцитохимических (ИЦХ) исследований в диагностике папиллярного рака щитовидной железы (ЩЖ). Как известно, ИЦХ методы используются для выявления органоспецифических, тканеспецифических маркеров, а также маркеров малигнизации. Эти исследования необходимы для иммунофенотипирования лимфом, прогнозирования опухолевой агрессии и определения чувствительности к терапии. В лаборатории морфологии эндокринной системы разработаны методы окраски, которые позволяют при помощи одного препарата провести цитоморфологическое и ИЦХ исследование, что избавляет пациента от осуществления дополнительных пункций.
В ЩЖ выделяют три типа клеток: А-клетки, для которых характерными маркерами являются тиреоглобулин и тиреопероксидаза; В-клетки (сукцинатдегидрогеназа) и С-клетки (кальцитонин и раковый эмбриональный антиген). Очень важно правильно определить, из каких клеток состоит опухоль ЩЖ, так как в зависимости от этого осуществляется выбор лечения. Из А-клеток развиваются папиллярные и фолликулярные опухоли, которые в большинстве случаев успешно поддаются радиойодтерапии. Наличие В-клеток свидетельствует о формировании В-клеточной карциномы, при которой эффективность радиойодтерапии значительно ниже. Из С-клеток развивается медуллярная карцинома ЩЖ, для которой характерным маркером является кальцитонин, а проведение радиойодтерапии неэффективно.
Клетки папиллярного рака имеют разную морфологию, поэтому при появлении метастазов цитоморфологические исследования не могут дать ответ о происхождении метастаза. Необходимо провести ИЦХ исследование, выявление тиреоглобулина свидетельствует о тиреоидной природе метастатического очага. Основная проблема состоит в том, что большинство таких метастазов имеют кистозное строение, их середина заполнена серозной жидкостью, а содержание пристеночного компонента незначительно. В результате получение информативных биоптатов затруднительно (до 42% случаев неинформативных пункций). Выходом из этой ситуации является определение внеклеточного тиреоглобулина в биоптате, что позволяет снизить количество неинформативных биопсий до 8% случаев.
Медулярные карциномы – наиболее распространенная и разнородная группа опухолей ЩЖ, достоверным маркером для которых является кальцитонин. При отсутствии тиреоглобулина в биоптате метастатического очага обязательно исследуется кальцитонин, при отрицательной реакции определяют наличие комбинации цитокератинов (ЦК) 7 и 20. В случае, если определяется ЦК 7, можно говорить о первичном очаге в легком, яичнике или грудной железе, если только ЦК 20 – о колоректальной карциноме, при комбинации указанных цитокератинов – о раке яичника или поджелудочной железы. При отсутствии указанных выше ЦК первичный очаг может быть в печени, почке, простате, это может быть метастаз нейроэндокринной или плоскоклеточной карциномы, что сужает круг поиска.
Произведен поиск иммуноцитохимических признаков малигнизации. Показано, что активность тиреоидной пероксидазы в доброкачественных опухолях ЩЖ значительно превышает таковую у злокачественных. Если этот фермент определяется в >80% клеток, можно предполагать доброкачественный характер заболевания. Содержание ЦК 17 значительно ниже в клетках доброкачественных опухолей ЩЖ (не превышает 0,25%). Маркер пролиферации Кi-67, по данным лаборатории, не является признаком злокачественного роста и встречается при тиреоидите, а также в 10% случаев доброкачественных опухолей.
Папиллярная карцинома хорошо лечится и имеет благоприятный прогноз, но ее лечение основано на радиойодтерапии, способности клеток захватывать и удерживать йод. Однако метастазы могут терять способность захватывать и удерживать йод, что коррелирует с неэффективностью радиофармпрепарата. Осуществление наиболее ранней диагностики и прогнозирование радиойодрезистентного метастаза являются крайне актуальными. За рубежом с этой целью проводится исследование мутации гена BRAF – метод дорогостоящий и не всегда эффективный.
Украинскими учеными разработан собственный метод дооперационного прогнозирования радиорезистентности, основанный на определении ЦК 17 в первичной опухоли. Если уровень ЦК17 высок – велика вероятность возникновения радиорезистентных метастазов. Если в послеоперационном периоде обнаруживаются метастазы, проводится определение тиреоидной пероксидазы, наличие которой коррелирует с радиочувствительностью.

В рамках форума также выступили молодые специалисты ИЭПОР. О цитологических и иммунофенотипических особенностях опухолевых клеток, ассоциированных с чувствительностью к лекарственным препаратам, рассказала от имени коллектива авторов старший научный сотрудник отдела экспериментальных клеточных систем ИЭПОР, кандидат биологических наук Наталья Александровна Безденежных. Следует отметить, что в 2014 г. исследование, в котором изучалось подавление злокачественности опухолевых клеток и повышение чувствительности к лекарственным препаратам, было удостоено премии Президента Украины для молодых ученых. Отдел регуляторных механизмов клетки ИЭПОР представила Ольга Бреева с докладом «Использование технологии Comet assay для оценки генетической нестабильности лимфоцитов периферической крови онкологических больных». Рассматривался новый метод, основанный на регистрации особенностей подвижности фрагментов ДНК в постоянном электрическом поле. При миграции ДНК образует электрофоретический след, напоминающий хвост кометы, параметры которого зависят от уровня повреждения ДНК. Национальный научный центр радиационной медицины НАМН Украины представила Оксана Михайловна Литвинец, посвятившая свое выступление обзору новых исследований в изучении гистогенеза рака легкого.
Участники и организаторы научно-практического семинара солидарны в том, что развитие цитологической диагностики, достижение мировых стандартов ее проведения являются одними из ключевых аспектов, определяющих успех лечения онкологических больных. Объединенный форум стал примером взаимной поддержки и плодотворного сотрудничества ученых двух институтов и цитологов из разных регионов Украины, что особенно важно в непростых реалиях сегодняшнего дня.

Более подробно с материалами докладов можно ознакомиться на официальном сайте ИЭПОР: www.iepor.org.ua.

Подготовила Катерина Котенко