30 грудня, 2022

Віруліцидна ефективність льодяників із фіксованою комбінацією цетилпіридинію хлориду та бензидаміну гідрохлориду проти вірусу грипу А

Автори:

Андрій Штаєр, Тіна Мікулетич, Тяша Церар Кішек, Тіна Триглав, Словенія

На тлі епідемії коронавірусної інфекції SARS-CoV-2 актуальними стали пошуки ефективних методів лікування та запобігання інфекції. Препаратами, що, з-поміж інших, привернули до себе увагу, стали пероральні антисептики – завдяки своїй здатності до зниження вірусного навантаження в ротовій порожнині та зменшення ризику передачі інфекції. До таких антисептиків належить, зокрема, цетилпіридинію хлорид (ЦПХ), наявні наукові дані щодо якого демонструють найбільш обнадійливі результати з огляду на його широкий спектр антибактеріальної та противірусної дії [1]. За результатами деяких клінічних досліджень, ополіскувачі для ротової порожнини, що містять ЦПХ, здатні знижувати вірусне навантаження SARS-CoV-2, що вказує на потенційні можливості цієї активної речовини в боротьбі з COVID-2019 [2, 3]. ЦПХ як самостійна активна речовина або в комбінації з іншими активними речовинами зазвичай міститься в засобах для місцевого перорального застосування у формі рідини для полоскання ротової порожнини, льодяників і спреїв.

Респіраторні вірусні інфекції є одними з найпоширеніших захворювань у світі. Зазвичай вони проявляються у вигляді таких симптомів, як біль у горлі, кашель, підвищення температури тіла, запалення слизової оболонки носа. Хоча в більшості випадків вірусні інфекції зникають самостійно і не потребують особливого лікування, хворі часто вдаються до самолікування різними препаратами, що полегшують симптоми або усувають причину інфекції [4]. Льодяники з фіксованою комбінацією бензидаміну гідрохлориду (БГ) та ЦПХ є клінічно ефективними щодо усунення симптомів болю в горлі [5]. Результати нещодавнього дослідження in vitro також підтвердили їхню віруліцидну дію на вірус SARS-CoV-2 [6]. Віруліцидна ефективність ЦПХ доведена також проти різних штамів вірусу грипу, оскільки дослідження in vitro підтвердили руйнування вірусної оболонки під впливом цієї активної речовини [7].Мета дослідження, проведеного нами в Інституті мікробіології та імунології медичного факультету в умовах in vitro, – підтвердити віруліцидну дію льодяників із фіксованою комбінацією БГ/ЦПХ на вірус грипу A та одночасно порівняти віруліцидну дію ЦПХ та комбінації БГ/ЦПХ у вигляді вільних активних речовин. Метою було також оцінити потенційний вплив на віруліцидну ефективність інших активних речовин (БГ) і допоміжних речовин у складі льодяника.

Методи

Дослідження проводилося відповідно до методів і вимог, встановлених стандартом Словенського інституту стандартизації до оцінки віруліцидної активності лікарських засобів для застосування людиною [8]. Умови дослідження та тривалість експозиції були обрані та пристосовані до фізико-хімічних властивостей ротової порожнини у людини з урахуванням таких чинників, як температура, склад (біологічне навантаження) і кількість слини, що виділяється в процесі розчинення льодяника, а також динаміки розчинення льодяників (за різної тривалості експозиції).

Виділення та кількісний аналіз вірусу

Досліджуваний ортоміксовірус, тобто вірус грипу А, штам A/Victoria/3/75, підтип гемаглютинін 3, нейрамінідаза 2 (H3N2), був отриманий з Американської колекції типових культур (American Type Culture Collection, ATCC). Попередньо було здійснено розмноження на культурі клітин і визначено кількість вірусу. Використовувалася клітинна лінія MDCK – собача нирка Мадін-Дарбі (Madin-Darby canine kidney, MDCK) і найменше основне живильне середовище з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки (fetal bovine serum, FВS) і трипсину з бичачої підшлункової залози (trypsin from bovinepancreas, TPCK) у кінцевій концентрації трипсину 2 мкг/мл. Концентрацію вірусного ізоляту визначали методом Спірмена – Кербера [9]. Для кожного штаму вірусу визначено розведення вірусу (виражене в одиницях вірусу на 1 мл), за якого вірус інфікує 50% клітин у культурі – медіанна інфікуюча доза для культури тканини (median tissue culture infectious dose, TCID50/мл). Вихідна концентрація розмноженого вірусу становила 109,41 TCID50/мл (табл. 1).

Випробування на віруліцидність та контрольні процедури

Досліджувані субстанції розчиняли у жорсткій воді з додаванням «інтерферувальної речовини» (далі – суспензія) з метою створення умов із біологічним навантаженням, що імітує склад слини. Суспензією був розчин бичачого сироваткового альбуміну (bovine serum albumin, BSA) 3,0 г/л води з еритроцитами в концентрації 3,0 мл/л. На культури вірусу діяли досліджуваними субстанціями за температури 37 °C протягом 1, 5 та 15 хв, що відповідає середньому часу розсмоктування льодяників (5-10 хв). Застосовували 3 концентрації досліджуваних субстанцій, отримані шляхом розчинення досліджуваної субстанції в 4 (висока), 20 (середня) та 30 мл (низька концентрація) суспензії. Досліджувані субстанції наведені в таблиці 2.

Окрім досліджень із метою оцінки віруліцидної дії кожної досліджуваної субстанції, проводили також відповідні контрольні процедури: контроль клітин і вірусу, контроль вірусу протягом усього періоду інкубації, пригнічення активності досліджуваної субстанції в крижаному клітинному середовищі, вплив досліджуваної субстанції на чутливість клітини до вірусу та її цитотоксичний ефект на клітини.

Результати контрольних процедур

В умовах дослідження вірус залишався стабільним протягом усього періоду дослідження, значного зниження концентрації інфекційних вірусних частинок не спостерігали. Було продемонстровано інгібуючий вплив крижаного середовища на дію досліджуваної субстанції у високій концентрації (досліджувана субстанція, розведена в 4 мл середовища). Титр вірусу до і після експозиції істотно не відрізнявся і не перевищував різницю в 1-log10 (c) від значення концентрації, встановленого як граничне значення згідно зі стандартними рекомендаціями.

Жодна з досліджуваних субстанцій у найвищій нецитотоксичній концентрації не вплинула на чутливість клітин до вірусу. Спостерігали лише дуже незначні, але прийнятні відхилення.

Цитотоксичність досліджуваних субстанцій у високій концентрації перевіряли в розведеннях від 10-1 до 10-11. Цитотоксичність із деформацією або руйнуванням клітинного шару досліджуваних субстанцій ЦПХ, комбінації БГ та ЦПХ у вигляді вільних активних речовин, льодяників із БГ і ЦПХ зі смаком евкаліпта та льодяників плацебо зі смаком евкаліпта виявили в розведеннях 10-1 та 10-2. Проте для льодяників зі смаком лимона та меду з БГ і ЦПХ та льодяників плацебо зі смаком лимона та меду цитотоксичність виявили лише в розведенні 10-1. З огляду на це визначили межу для встановлення цитопатичного ефекту вірусу. Рівень цитотоксичності відносно розведення вірусу в досліджуваній суспензії наведено в таблиці 4.

Результати ефективності досліджуваних субстанцій на інактивацію вірусу

Вірус зазнавав впливу кожної концентрації шляхом проведення двох аналізів у різні дні. Кінцевий результат відображено як середнє значення результатів обох аналізів. Результати експозиції в числовій формі наведені в таблицях 3 та 4, а в графічній – на рисунках 1-3.

Рис. 1. Експозиція вірусу грипу А в досліджуваній субстанції в найвищій концентрації (еквівалент розчинення одного льодяника у 4 мл суспензії) у трьох різних значеннях часу експозиції

Примітки. TCID50/мл – 50%-ва доза; що інфікує культуру тканини; ЛЕ – льодяник, евкаліпт; ЛЛМ – льодяник, лимон, мед.

Рис. 2. Експозиція вірусу грипу А в досліджуваній субстанції в середній концентрації (еквівалент розчинення одного льодяника в 20 мл суспензії) у трьох різних значеннях часу експозиції

Рис. 3. Порівняння зниження кількості інфекційних вірусів у найвищій концентрації (еквівалент розчинення одного льодяника у 4 мл суспензії) у трьох різних значеннях часу експозиції

Примітки. TCID50/мл – 50%-ва доза; що інфікує культуру тканини; ЛЕ – льодяник, евкаліпт; ЛЛМ – льодяник, лимон, мед

Віруліцидна дія була сильно вираженою при найвищій концентрації, що еквівалентно розчиненню одного льодяника в 4 мл суспензії. При середній концентрації, що еквівалентно розчиненню одного льодяника в 20 мл суспензії, віруліцидна дія була вираженою, але зі зміненою динамікою, оскільки подібні ефекти спостерігалися лише через 15 хвилин.

Результати демонструють помітну різницю між віруліцидною дією льодяників, що містять активні речовини, та льодяників плацебо. Така різниця є найбільш помітною при високих і середніх концентраціях, але також спостерігається і при низьких концентраціях.

Обговорення

Віруліцидна дія ЦПХ на вірус грипу вже була досліджена та підтверджена раніше в деяких інших дослідженнях [7]. Проведене нещодавно дослідження in vitro продемонструвало віруліцидну дію на вірус SARS-CoV-2 льодяників із комбінацією БГ та ЦПХ. Концентрація вірусу в суспензії з найвищою концентрацією вже за хвилину знизилася на 4 log10(c) [6].

Це дослідження, як очікувалося, продемонструвало подібні тенденції віруліцидної активності льодяників із комбінацією БГ та ЦПХ щодо вірусу грипу А, оскільки в обох випадках використані in vitro віруси з оболонкою, на які, як передбачається, ЦПХ має пряму дію [6, 7].

Дослідження проводилося за однаковим протоколом і за тих самих умов, що й дослідження з вірусом SARS-CoV-2.
Істотною відмінністю був лише трипсин у підтримувальному середовищі, додавання якого потрібно для забезпечення інфекційності вірусу грипу. У зв’язку з надзвичайно низькою концентрацією трипсину в живильному середовищі його дію на досліджувану субстанцію не перевіряли, оскільки початкова інкубація вірусу з активною речовиною була без цієї добавки. Трипсин додавали лише в те середовище, в якому були приготовані розведення досліджуваної субстанції з вірусом, перед нанесенням на культури клітин.

Найвища віруліцидна дія всіх досліджуваних субстанцій, як очікувалося, спостерігалася в суспензії з високою концентрацією, де було доведено, що концентрація інфекційних вірусів уже через 5 хв знижується більш ніж на 4 log10(c) (зниження у 10 000 разів, або на 99,99 %). Льодяники з комбінацією БГ і ЦПХ (зі смаком евкаліпта, лимона та меду) досягли зниження на 4 log10(c) вже через 1 хв (рис. 1 і 3).

Зважаючи на всі контрольні процедури, результати свідчать про високу віруліцидну ефективність досліджуваних субстанцій. Віруліцидна дія льодяників плацебо (зі смаком евкаліпта, лимона та меду) значно нижча за дію льодяників із комбінацією БГ та ЦПХ, як показано на рисунках 1 і 3 та в таблиці 4. Льодяники з комбінацією БГ та ЦПХ досягли відповідного зниження концентрації інфекційних вірусів на 4 log10(c) також у суспензії із середньою концентрацією. Ураховуючи всі параметри динаміки розчинення льодяника та слиновиділення (приблизно від 4,0 до 5,0 мл/хв при стимуляції, наприклад розсмоктуванні льодяника), найбільше наблизилися до передбачуваної концентрації, яка могла б бути досягнута при фактичному вживанні льодяника, припускаючи, що на розчинення льодяника потрібно 5-10 хв [10]. ЦПХ і комбінація БГ та ЦПХ у вигляді вільних активних речовин також наблизилися до межі зниження на 4 log10(c).

Як і в попередньому дослідженні in vitro із SARS-CoV-2, так і в дослідженні штаму вірусу грипу досліджувані субстанції в низьких концентраціях не продемонстрували зниження на 4 log10(c) навіть через 15 хв [6]. Чітка тенденція до зниження кількості вірусу спостерігалася протягом 15 хв контакту із суспензіями досліджуваних субстанцій при всіх концентраціях (за винятком льодяників плацебо).

Льодяники з комбінацією як БГ та ЦПХ, так і БГ та ЦПХ у вигляді вільних активних речовин продемонстрували чітку динаміку віруліцидної активності – найшвидше ефекти виявлялися при найвищій концентрації, а швидкість дії знижувалася зі зменшенням концентрації. Крива зниження концентрації вірусів із часом ставала все більш пласкою при середній, а ще більше – при найнижчій концентрації (рис. 1 і 2). Така динаміка не спостерігалася з льодяниками плацебо (з обома смаками), щодо яких через 15 хв спостерігався постійний ефект зниження концентрації інфекційних вірусів від 1,94 до 2,82 log10(c). Як було встановлено під час досліджень in vitro з вірусом SARS-CoV-2, чинником інактивації вірусів, імовірно, є також низьке значення рН, аналогічне до значення у льодяників із комбінацією БГ і ЦПХ [6].

Однією з найважливіших властивостей, які повинен мати пероральний антисептик, є стійкість у місці нанесення. Відомо, що стійкість ЦПХ висока (від 3 до 5 год), завдяки чому його ефективність проти вірусу може бути вищою та тривалішою [1].

Крім того, досягненню вищої ефективності може сприяти також лікарська форма. Лікарськими формами для місцевого полегшення болю в горлі є ополіскувачі для ротової порожнини, спреї та льодяники. Було доведено, що після застосування льодяників активна речовина затримується в ротовій порожнині більшою мірою і змивається повільніше, ніж при застосуванні спреїв і ополіскувачів для ротової порожнини. Це свідчить про те, що ефект льодяників може бути тривалішим [11].

Результати досліджень ґрунтуються на контрольованих лабораторних умовах, що імітують фізіологічні умови в ротовій порожнині.

Через низку факторів результати дослідження in vitro не можна перенести на умови in vivo, навіть якщо взяти до уваги фізико-хімічні умови, до яких ми намагалися наблизитися. Дослідження лише продемонструвало, що ЦПХ, комбінація БГ та ЦПХ у вигляді вільних активних речовин, як і комбінація БГ та ЦПХ у льодяниках, мають віруліцидну дію і з однаковою ймовірністю могли б діяти на слизові оболонки рота та глотки. У будь-якому випадку віруліцидна дія була б обмежена вільними інфекційними вірусами в слизовій оболонці або слині, які зазнавали б безпосередньому впливу активної речовини. За даними літератури, концентрація вірусних частинок у слині коливається в діапазоні від 4 до 6 log10(с) копій геному на 1 мл [12]. У цьому дослідженні концентрація вірусу була набагато більшою (8-10 log10(c) інфекційних вірусних частинок на 1 мл). Подальші дослідження мали б сенс у контексті клінічних випробувань. Якби результати показали аналогічну ефективність, застосування льодяників із комбінацією БГ та ЦПХ могло б значною мірою вплинути на зниження ймовірності передачі вірусу повітряно-краплинним шляхом.

Дослідження in vitro підтвердило віруліцидну активність ЦПХ та комбінації БГ і ЦПХ у вигляді вільної активної речовини та у формі льодяників щодо вірусу грипу А.

Найбільшу ефективність, що суттєво відрізнялася від ефективності льодяників плацебо, продемонстрували льодяники з комбінацією БГ та ЦПХ; вона була порівнянною з ефективністю льодяників зі смаком евкаліпта та льодяників зі смаком лимона та меду.

Список літератури – у редакції.

Steyer A. et al. Virucidal Efficacy of Lozenges with a Fixed-Dose Combination of Cetylpyridinium Chloride and Benzydamine Hydrochloride Against Influenza A Virus. Med Razgl.2022; 61 (1):121-30.

Тематичний номер «Пульмонологія, Алергологія, Риноларингологія» № 3 (60) 2022 р.

Номер: Тематичний номер «Пульмонологія, Алергологія, Риноларингологія» № 3 (60), 2022 р.