27 березня, 2015
Устойчивость спор и вегетативных клеток Bacillus clausii к пробам, имитирующим транзит по желудочно-кишечному тракту
Bacillus clausii – грамположительная, аэробная, эндоспорообразующая, факультативная алкалофильная палочковидная бактерия. B. clausii продуцирует каталазу и оксидазу, гидролизует желатин и крахмал, восстанавливает нитраты, растет при температуре от 30 до 50° C и в присутствии NaCl (до 10%). Организмы этого вида не гидролизуют пуллулан и Твин. Совокупное содержание гуанина и цитозина в ДНК составляет около 43 моль% (Nielsen et al., 1995).
Штаммы Bacillus clausii часто обнаруживаются как составляющие микрофлоры
почвы, а некоторые их свойства могут использоваться в важных областях применения
промышленных и биотехнологических отраслей, а именно в производстве щелочной
протеазы и ксиланазы (Nielsen et al., 1995; Denizci et al., 2004; Joo et al.,
2003; Kumar et al., 2004). Кроме того, B. clausii наряду с прочими
спорообразующими бациллами является важным для человека пробиотиком (Bacillus
subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus coagulans, Bacillus cereus var. vietnami) (Sanders
et al., 2003). В рамках последнего таксономического пересмотра, основанного на
молекулярном анализе (Green et al., 1999; Hoa et al., 2000; Senesi et al.,
2001), в состав вида B. clausii было включено четыре устойчивых к действию
антибиотиков штамма (прежде классифицировались как B. subtilis), которые входят
в состав пробиотического препарата Энтерожермина, применяемого для пероральной
профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).
Энтерожермина применялась в Италии в виде споровой суспензии около 40 лет, а в
настоящее время этот препарат доступен и в других странах.
На протяжении долгих лет считалось, что споры вида Bacillus не в состоянии
размножаться в такой среде с низким окислительно-восстановительным потенциалом,
как ЖКТ. Однако недавно были продемонстрированы адаптация к ограниченному
содержанию кислорода и анаэробный рост B. subtilis (Nakano, Zuber, 1988; Marino
et al., 2000). Размножение бацилл спорами в тонком кишечнике позднее наблюдалось
в модели с крысами при использовании подходов формирования культуры и молекул (Hoa
et al., 2001; Casula, Cutting, 2002; Duc et al., 2003). По данным литературы
пробиотическое действие Энтерожермины эффективно в профилактике и лечении острой
диареи и кишечных инфекций (Mazza, 1994), минимизации негативных эффектов
антибиотикотерапии со стороны ЖКТ (Mazza et al., 1992; Nista et al., 2004),
иммуномодулирующему действию путем стимуляции синтеза иммуноглобулинов (IgA, IgG)
и регуляции цитокинов у человека (Muscettola et al., 1992; Duc et al., 2003;
Ciprandi et al., 2004). Экспериментальные исследования показывают, что штамм O/C
обладает противомикробным действием в отношении грамположительных видов
(например, Staphylococcus aureus и Clostridium difficile) и способен как
стимулировать рост CD4+ Т-клеток, так и активировать популяции лейкоцитов в
селезенке и брюшине экспериментальных животных (Urdaci et al., 2004). Кроме
этого способность B. clausii ингибировать генотоксическое действие
4-нитрохинолин-1-оксида (мощного канцерогена) была показана в лабораторных
условиях в ходе краткосрочного исследования бактерий (Caldini et al., 2002).
Данные как экспериментальных, так и клинических исследований однозначно
демонстрируют пробиотическое действие B. clausii. Тем не менее, некоторые
механизмы, относящиеся к гибели этих бактерий в желудочно-кишечном тракте,
требуют дальнейшего изучения.
Способность вегетативных клеток выживать в желудочно-кишечном тракте после
прохождения через желудок, представляет собой важную область исследования.
Желчные кислоты оказывают мощное противомикробное действие, поэтому флора ЖКТ
выработала механизмы сопротивления действию желчи (Gunn, 2000). По сравнению с
грамотрицательными грамположительные бактерии, как правило, менее устойчивы к
желчным кислотам, выделяющимся в двенадцатиперстную кишку, таким как N-ацильные
соединения, конъюгированные с глицином или таурином (Ahn et al., 2003). Во
многих исследованиях получены данные о способности лактобацилл и бифидобактерий
переносить кислотность желудка и действие желчных солей, присутствующих в ЖКТ, с
вариабельностью между штаммами (Charteris et al., 1998; Prasad et al., 1998;
Haller et al., 2001). Стало известно об устойчивости спор Bacillus к кислотам, а
также было подтверждено значение кислотности для активирования размножения
спорами (Ciffo et al., 1987; Mazza, 1994; Faille et al., 2002). Также имеются
данные об устойчивости спорообразующих пробиотиков к действию желчи (Hyronimus
et al., 2000; Spinosa et al., 2000), а общий коэффициент выживаемости спор
Энтерожермины был подтвержден при использовании искусственного желудочного сока;
меньший коэффициент выживаемости (77-83%) наблюдался при воздействии на них
искусственным кишечным соком на протяжении 3 ч (Duc et al., 2004). Несмотря на
это, убедительные доказательства устойчивости вегетативных клеток к действию
кислоты и желчи пока не получены.
Целью настоящего исследования было изучить устойчивость четырех пробиотических
штаммов B. clausii к действию кислоты и желчи при изучении влияния
конъюгированных и свободных желчных солей (CBS-FBS) и сравнить их поведение с
поведением совокупности штаммов того же вида и контрольных штаммов B. subtilis.
Указанные бактерии также анализировали с целью определения таких свойств, как
алкалофильный рост.
Материалы и методы
Штаммы бактерий
Четыре пробиотических штамма B. clausii (O/C, N/R, SIN и T), а также
соответствующая смешанная форма (MIX), представляющая собой препарат
Энтерожермина, были получены в виде суспензий спор от компании (дата
приготовления: 21 января 2002; в MIX содержатся четыре штамма в тех же
пропорциях). Контрольный набор штаммов был предоставлен в лиофилизированной
форме компаниями DSM (Германия) и ATCC (США). Эти штаммы были такие: B. clausii
DSM 8716Т, DSM 2512, DSM 9783; B. subtilis ATCC 6051Т, ATCC 33677. Споры
и лиофилизированные формы оживляли в питательном бульоне (ПБ) Лурия (триптон 10
г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 5 г/л) и инкубировали при температуре 37° C
на протяжении 24-48 ч.
Питательные среды
Кинетику роста исследовали в питательном бульоне (ПБ), подсчет
жизнеспособных спор проводили на питательном агаре (ПА). Среды были
предоставлены компанией Oxoid (Англия). Споры набора штаммов были получены на
агаре из почвенной вытяжки (пептон 5 г, говяжья вытяжка 3 г, бактериальный агар
15 г, водопроводная вода 750 мл, автоклавированная почвенная вытяжка 250 мл) (Gordon
et al., 1973).
Желчные соли
В исследовании использовали экстракт бычьей желчи L55 (Oxoid), содержащий
конъюгированные гликолат и таурохолат натрия (CBS); бычью желчь B-8381 (Sigma-Aldrich,
США), содержащую CBS-FBS; желчные соли B-8756 (Sigma-Aldrich), содержащие
свободные соли холевой кислоты и натрия дезоксихолат (FBS) в соотношении 1:1.
Желчные соли растворяли в дистиллированной воде, фильтровали через мембрану с
диаметром пор 0,45 мкм (Sartorius, Германия) и добавляли в стерильную среду.
Процедура
Споры и вегетативные клетки изучали на предмет их устойчивости к
экспериментальному воздействию. В ходе различных проб бактерии добавляли в
жидкую среду или физиологический раствор (в зависимости от пробы) и инкубировали
на протяжении 24-48 ч при температуре 37° C наряду с контрольными штаммами.
Кинетику роста изучали при помощи автоматического биофотометра (Bonet-Maury,
Франция) при длине волны 620 нм на протяжении 24 ч. Начальную и конечную
жизнеспособность клеток анализировали посредством высевания соответствующих
разведений на твердых средах с последующим инкубированием при температуре 37° C
и pH 8,0 (если не указано иное).
Устойчивость к действию щелочей
Кинетику роста изучали в ПБ при pH 8,0 и 10,0. Значения pH получали при
помощи натрия сесквикарбоната 0,1 моль/л (Fritze et al., 1990).
Устойчивость к действию кислот
Выживаемость спор и вегетативных клеток оценивали после 1-2-часового
воздействия кислотой в физиологическом растворе. Значения pH 2,0; 4,0 и 6,0
получали с помощью HCl 0,2 моль/л, цитратного буфера 0,2 моль/л и фосфатного
буфера 0,2 моль/л соответственно (Ciffo et al., 1987; Gotcheva et al., 2002).
Жизнеспособность определяли путем высевания на твердых средах.
Устойчивость к действию желчи
Устойчивость к действию желчи определяли путем инкубации вегетативных клеток
в ПБ, содержащем CBS или смесь CBS-FBS с конечными концентрациями в 0,5 и 1%
объемного веса. Кинетику роста и жизнеспособность оценивали на протяжении 24 ч.
Уровни желчи были выше обычно выбираемых уровней для исследования устойчивости
пробиотиков (Charteris et al., 1998; Prasad et al., 1998; Hyronimus et al.,
2000). Значения pH были приведены до 8,0 в соответствии с экспериментальными
протоколами, разработанными для лактобацилл (Charteris et al., 1998; Haller et
al., 2001) и пропионовых бактерий (Huang, Adams, 2004). Фактически pH желчи и
поджелудочного сока, выделяемого в кишечник, составляет примерно 8,0.
Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) определяли в пробирках с ПБ,
содержащим CBS или CBS-FBS (0,3-0,5-1,0-1,5-2,0% объемного веса) и FBS
(0,1-0,2-0,3-0,4-0,5% объемного веса). Считывание осуществлялось через 24 и 48 ч
инкубации при температуре 37° C.
Устойчивость к последовательному действию кислоты и желчи
Имитацию транзита по ЖКТ проводили по методике Haller и соавт. (2001). Споры
вначале инкубировали при рН 2,0-3,0 в физиологическом растворе в течение 1-2 ч,
затем помещали в 1% желчный бульон (CBS). Начальная концентрация спор составляла
107/мл (Ciffo et al., 1987).
Микроаэрофильный и анаэробный рост
Опыты проводили в анаэробной системе GasPak с применением коммерческих
газогенерирующих комплектов CampyGen CN25 (микроаэрофильный рост) и AnaeroGen
AN25 (анаэробный рост), полученных от компании Oxoid (Англия). Споры высевали в
ПБ или ПА и инкубировали на протяжении 24-48 ч при температуре 37° C. Анаэробный
рост также изучали с применением тех же сред, но с добавлением NaNO3 1 г/л.
Результаты
Влияние pH на кинетику роста
Штаммы B. clausii исследовали на предмет способности развиваться в щелочной
среде, что является важной таксономической характеристикой вида. Была
подтверждена устойчивость всех исследованных бактерий к воздействию щелочи, а
также были отмечены незначительные различия между штаммами. В таблице 1
показано, что значение рН влияет как на время задержки, так и на темп роста в
экспоненциальной фазе. В отличие от штаммов N/R и T штаммы O/C и SIN показывали
краткое время задержки при pH 7,0, тогда как все штаммы показывали сокращение
времени жизни поколения при переходе из нейтральной среды в щелочную.
В щелочной среде (pH 8,0 и 10,0) темпы роста штаммов O/C, N/R, SIN и T были
схожими, тогда как при pH 7,0 темпы роста штаммов O/C и SIN были больше (рис. 1). После 24 ч инкубации культуры, полученные из смешанного инокулята MIX,
показали схожие темпы роста в щелочной и нейтральной средах. Это означает, что
рост MIX при pH 7,0 главным образом происходил за счет штаммов O/C и SIN. Темпы
роста контрольного штамма DSM 8716Т были схожими с таковыми пробиотических
штаммов, следовательно, pH 8,0 является оптимальным для их роста.
Устойчивость к действию желчи
При применении CBS-FBS наблюдалась различная степень устойчивости. МИК
конъюгированных солей и смеси CBS-FBS для четырех пробиотических штаммов были
большими, чем 2,0%, тогда как для B. clausii DSM 8716Т значения МИК составляли
соответственно 2,0 и 1,5% для CBS и FBS. Ингибирующее действие свободных солей
было в десять раз большим, чем действие CBS и смеси CBS-FBS. Полученные в
результате МИК свободных солей составляли 0,1 и 0,2% через 24 и 48 ч
соответственно. Все рассматриваемые бактерии были способны развиваться в ПБ,
содержащем 0,5 и 1% CBS, даже если достигнутые через 24 ч инкубации концентрации
клеток были в целом ниже, чем концентрации контрольных культур в отсутствие
желчи (рис. 2).
На рисунке 3 показано, что в присутствии конъюгированных солей рост не
прекращался, а только задерживался и существенным образом не уменьшался. Эффект
концентрации желчи проявляется как при увеличении времени задержки, так и при
уменьшении времени роста при изменении содержания желчи от 0 до 0,5% и 1%.
Поведение пробиотических штаммов было схо-жим с таковым контрольного штамма DSM
8716Т. Похожие профили роста были получены при изучении действия смеси CBS-FBS.
Сравнивая показатели роста пробиотических штаммов по отношению к контрольным в
отсутствие желчи (рис. 4), мы подтвердили, что они были выше в присутствии CBS,
чем в присутствии FBS. Устойчивость пробиотических штаммов к действию желчи не
отличалась от таковой B. clausii DSM 8716Т, и она была более
очевидной, чем устойчивость B. subtilis ATCC 6051Т.
Действие совокупности кислот и желчи на размножение спор
Предварительный мониторинг подтвердил 2-часовую устойчивость пробиотических спор
к действию кислот при значении pH до 2,0, тогда как вегетативные клетки
сохраняли устойчивость при pH 6,0 и были подвижными при pH ≤4,0. В ходе пробы с
имитацией транзита по ЖКТ было установлено, что у всех исследованных штаммов
реакция на воздействие кислот и желчи была схожей. В частности, на рисунке 5
показано, что количество клеток, подсчитанное после предварительной инкубации
спор при pH 2,0 на протяжении 2 ч, было схожим с количеством клеток в
необработанных контрольных суспензиях. При последующем воздействии смесью
CBS-FBS имело место временное нарушение размножения спорами. Фактически после 1
ч воздействия количество клеток уменьшилось. Нарушение размножения было
устранено увеличением времени инкубации до 24 ч.
Развитие в микроаэрофильных и анаэробных средах
В таблице 2 показано, что все изучаемые штаммы B. clausii и B. subtilis были
способны развиваться в микроаэрофильных условиях в жидкой и твердой средах. В
этих же средах при анаэробной инкубации роста не наблюдалось, однако четыре
пробиотических штамма B. clausii и один штамм B. subtilis (ATCC 33677)
отличались от прочих контрольных штаммов и могли развиваться в анаэробных
условиях при добавлении в среду нитрата натрия.
Обсуждение
Подобно росту B. clausii в щелочной среде, описанному как типичный для
этого вида (Fritze et al., 1990; Nielsen et al., 1995), наши результаты
подтвердили размножение спорами, а также рост в нейтральной среде. Это поведение
зависело от штаммов, и объемы роста, полученные для штаммов O/C и SIN, были
больше, чем объемы, полученные для штаммов N/R, T и типового штамма (DSM 8716Т).
При использовании суспензии штаммов MIX (Энтерожермина), содержащей четыре
штамма, рост не изменялся при значениях pH от 7,0 до 10,0, следовательно, объем
роста при pH 7,0 обеспечивался главным образом штаммами O/C и SIN. Адаптация
мультипробиотка Энтерожермины к pH может рассматриваться как важная
характеристика пробиотической функции, так как pH варьирует от 5,5-6,0 в толстой
(Ahn et al., 2003) до 8,0 в тонкой кишке (Huang, Adams, 2004).
Хорошо известно, что споры B. clausii в отличие от вегетативных клеток устойчивы
к действию кислот. В настоящем исследовании было подтверждено их размножение и
после комбинированного воздействия кислотами и желчью. Способность выдерживать
действие желчи, которая прежде считалась прерогативой кишечной микрофлоры, важна
для выживания бактерий в просвете кишечника. Таким образом, устойчивость B.
clausii к действию желчи должна представлять собой первичный интерес с учетом
отсутствия однозначных данных о размножении бацилл в пищеварительном тракте (Spinosa
et al., 2000; Casula, Cutting, 2002). Все штаммы показали существенные темпы
роста при инкубации в присутствии CBS и смеси желчных солей CBS-FBS. Следует
отметить, что испытанные концентрации (до 1%) были выше значений соответственно
в 0,3 и 0,5%, которые считаются критическими уровнями для хорошей и очень
хорошей устойчивости для пробиотиков (Charteris et al., 1998; Hyronimus et al.,
2000). В отличие от лактобацилл и бифидобактерий, относительно кото-рых
сообщалось об изменениях в штаммах в результате воздействия желчи (Charteris et
al., 2000), между пробиотическими и совокупными штаммами B. clausii не было
обнаружено соответствующих различий. Кроме того, устойчивость к действию желчи,
которая наблюдалась у B. clausii, была выше устойчивости B. subtilis, и мы
рассматри-ваем это как неотъемлемое свойство спорообразующих бацилл, которое у
разных видов разное. Фактически, обращаясь к литературным данным, МИК желчи
может оцениваться как 0,1; 0,7% и более 1% соответственно для штаммов Bacillus
laevolacticus, Bacillus racemilacticus и Bacillus coagulans (Hyronimus et al.,
2000).
Учитывая высокую чувствительность вегетативных клеток к FBS, мы наблюдали МИК
ниже 0,1% после 24 ч и равные 0,2% после 48 ч, что свидетельствует о том, что
первоначальный стресс был преодолен. Однако следует помнить, что в желчи
человека содержатся главным образом CBS (De Boever, Verstraete, 1999).
Рост и размножение в условиях анаэробиоза, когда штаммы выращивались в азотной
среде, также подтверждают способность В. clausii адаптироваться к среде
кишечника. Последнее свойство, характерное и для строгого аэроба B. subtilis (Nakano,
Zuber, 1998; Cruz Ramos et al., 2000; Marino et al., 2000), можно объяснить
высокой концентрацией цитохромов в алкалофильных бациллах, несмотря на то что
функции этих ферментов точно не определены (Yumoto et al., 1997).
Таким образом, описанные физиологические свойства исследованных штаммов B.
clausii, входящих в состав мультипробиотика Энтерожермина, подтверждают, что
споры этих штаммов способны размножаться, а вегетативные формы – выживать во
время транзита по желудочно-кишечному тракту, что свидетельствует об их высокой
пробиотической ценности.
Список литературы находится в редакции.
Journal of Applied Microbiology 2006;
101: 1208-1215