Определение содержания цитокинов в смывах из полости носа у детей-аллергиков после применения Bacillus clausii: экспериментальное исследование

27.03.2015

Респираторные инфекции у детей возникают очень часто. Как уже было продемонстрировано ранее, Bacillus clausii обладает иммуномодулирующими свойствами и безопасен в применении. Цель настоящего исследования состояла в выяснении того, может ли применение B. clausii у детей-аллергиков с рецидивирующими респираторными заболеваниями модулировать профиль цитокинов. Десять детей (средний возраст 4,4 года), посещающих детский сад, были включены в исследование по окончании учебного года (летом). Препарат, содержащий споры B. clausii (Enterogermina®, 2 млрд спор в каждом флаконе), применялся в дозе 2 флакона в сутки на протяжении 4 нед. Определенный набор цитокинов, в том числе интерлейкинов (IL)-1, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, интерферона
(IFN)-γ, трансформирующего фактора роста (TGF)-β и фактора некроза опухоли (TNF)-a, определялся методом иммуноферментного анализа в смывной жидкости из полости носа до и после лечения. Лечение с использованием B. clausii привело к существенному снижению уровней IL-4 (p<0,01) и существенному увеличению уровней IFN-γ (p<0,05), IL-12 (p<0,001), TGF-β (p<0,05), а также уровней IL-10 (p<0,05). Существенного влияния на другие цитокины не отмечено. Добавим, что в данном исследовании было продемонстрировано, что B. clausii может обладать иммуномодулирующим действием и влиять на профиль цитокинов, выявляемых в полости носа у детей-аллергиков, страдающих рецидивирующими респираторными инфекциями.

Респираторные инфекции у детей возникают очень часто, а их периодическое рецидивирование создает определенные сложности для врачей-педиатров, преимущественно в плане диагностики, выбора стратегии лечения и профилактики. Поскольку профилактика снижает потребность в лечении, профилактическое применение молока, содержащего пробиотики, как недавно было продемонстрировано, смогло снизить частоту возникновения респираторных инфекций и их тяжесть у детей, посещающих детские дошкольные учреждения [1]. Пробиотики представляют собой микроорганизмы, оказывающие положительное влияние на здоровье «хозяина». Взаимодействие между пробиотиком и организмом «хозяина» является достаточно сложным и разноплановым. Происходит стимуляция иммунной системы путем активизации иммунного ответа, опосредованного Т-хелперами 1 типа (Th1) и Т-регулирующими клетками (Tr1), а также снижения активности
Т-хелперов 2 типа (Th2) [2]. У детей, страдающих аллергией, отмечается поляризация иммунного ответа в сторону Th2, для которой характерны высокие уровни интерлейкина (IL)-4 и низкие – интерферона (IFN)-γ [3]. Поэтому пробиотики вполне могут считаться важным терапевтическим достижением в деле профилактики инфекций и атопии.
В этом отношении Bacillus clausii – безопасный и часто назначаемый пробиотик. В опубликованном недавно обзоре были представлены данные некоторых исследований, указывающие на его роль в профилактике инфекций желудочно-кишечного тракта у детей и модулировании иммунного ответа [4].
Поэтому наша цель состояла в изучении потенциального влияния B. clausii на профиль цитокинов, в том числе IL-1, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-γ, трансформирующего фактора роста (TGF)-β и фактора некроза опухоли (TNF)-α, у детей-аллергиков, страдающих рецидивирующими респираторными инфекциями.

Материалы и методы
Субъекты исследования.
Оценка проводилась среди десяти детей, посещающих дошкольное учреждение. У каждого пациента проводился тщательный сбор клинического анамнеза, а также физикальное и аллергологическое обследование. Демографические данные представлены в таблице.
Дизайн исследования. Для оценки профиля цитокинов в исследование была включена группа из 10 детей с диагностированной аллергией, у которых периодически возникали рецидивы респираторных инфекций. Диагноз аллергии ставился на основании клинического анамнеза, физикального обследования, а также кожной пробы накалыванием (прик-теста) с обычным набором аллергенов, описанной в различных источниках [5]. Рецидивирование респираторных инфекций определялось произвольным образом как 6 случаев инфекции в год. В исследование не включались дети, на протяжении предшествующих 4 нед принимавшие антигистамины, а также кортикостероиды для назального, ингаляционного и перорального использования.
Группа плацебо не была предусмотрена, так как основная цель исследования состояла в оценке иммунопатологических явлений, возникающих после приема B. clausii. В любом случае исследование было слепым для исследователя, проводившего определение содержания цитокинов.
Все дети перорально получали препарат, содержащий споры B. clausii (Enterogermina®; Sanofi-Synthelabo OTC, Милан, Италия – 2 млрд спор в каждом флаконе), в дозе 2 флакона в сутки на протяжении 4 нед. Исследование проводилось по окончании учебного года, летом, поскольку в этот период частота возникновения респираторных инфекций в нашей зоне является очень низкой.
Взятие смывов из полости носа проводилось у всех испытуемых до и непосредственно после применения B. clausii.
Исследование было одобрено Экспертным советом медицинского учреждения. От родителей было получено устное информированное согласие на участие их детей в исследовании.
Смывы из носа. Взятие смывов из полости носа проводилось с использованием 5 мл физиологического раствора хлорида натрия в соответствии со стандартной методикой, описанной во многих источниках [5]. Во время проведения манипуляции голова пациента была отклонена назад, при этом мягкое небо закрывало вход в глотку. Полученная жидкость была сопоставимой у всех субъектов исследования; ее собирали для определения уровней содержания цитокинов и хранили при температуре -20° C [5].
Оценка содержания цитокинов. Содержание цитокинов измерялось с методом ELISA – твердофазного иммуноферментного анализа (R&D Systems, США). При проведении анализа использовали количественную методику иммуноферментного сэндвич-анализа. Эта методика широко описана в различных публикациях [5].
Статистический анализ. Был проведен статистический анализ полученных данных с использованием многовариационного дисперсного анализа (M-ANOVA) и апостериорного сравнения с помощью теста Дункана. Соотношение Th2/Th1 рассчитывалось с помощью t-теста. Результаты, для которых значения p были меньше 0,05, считались статистически достоверными.

Результаты
У детей, принимавших назначенный препарат, содержащий споры B. сlausii, какие-либо побочные явления не наблюдались. Ниже приведен профиль цитокинов до и после лечения B. clausii.
После лечения уровни IL-4 значительно снизились (p<0,001; средние исходные показатели 4,49±1,45 стандартного отклонения (СО) и средние показатели после лечения 3,52±0,9 СО). При приеме Bacillus clausii значительно повысились уровни IFN-γ (p<0,05; средние исходные показатели 1,81±0,79 СО и средние показатели после лечения 2,65±0,69 СО) и IL-12 (p<0,001; средние исходные показатели 0,76±0,43 СО и средние показатели после лечения 1,36±0,81 СО). Под действием B. сlausii существенно возросли уровни TGF-β (p<0,05; средние исходные показатели 0,9±0,34 СО и средние показатели после лечения 1,33±0,51 СО), а также уровни IL-10 (p<0,05; средние исходные показатели 1,45±0,75 СО и средние показатели после лечения 2,05±0,72 СО).
Соотношение Th2/Th1 (IL-4/IFN-γ) существенно сократилось с 2,92±1,71 до лечения до 1,44±0,57 после лечения (p=0,018).
B. clausii не оказывал существенного влияния на другие изучаемые цитокины – IL-1, IL-3, IL-6 и IL-8 (данные не представлены).

Обсуждение
Высокая частота острых респираторных инфекций у детей является значительным бременем как для общества в целом, так и для каждой семьи.
У детей с аллергическими заболеваниями отмечается преобладание Th2 [3]. Известно, что цитокины Th2-клеток играют ведущую роль в развитии аллергического воспаления. Сегодня появляется все больше доказательств ключевого значения цитокина Th1 – IFN-γ – в прерывании развившейся аллергической реакции [6].
Пробиотики могут стимулировать иммунный ответ слизистых оболочек и активировать потенциальные антиаллергические и противовоспалительные процессы: Th1 иммунитет, контррегуляторный Tr1 иммунный ответ и синтез иммуноглобулина (IgA) [2]. Таким образом, способность пробиотиков восстанавливать иммунологические процессы, смещенные в сторону Th2, может стать значительным прогрессом в профилактике инфекции и атопии у детей.
Точные механизмы влияния пробиотиков на иммунный ответ еще изучаются. Однако в настоящее время появляется все больше доказательств необходимости специфического влияния кишечной флоры на иммунную систему в развитии и поддержании иммунотолерантности слизистых оболочек [7]. В частности, толерантность слизистой оболочки ротовой полости во многом зависит от подавления потенциальной реактивности лимфоцитов. Также было показано, что недавно изученные Tr1-клетки, вырабатывающие TGF-β и IL-10, вызывают уменьшение воспалительной реакции слизистой оболочки [8].
В исследованиях было установлено, что споры Bacillus clausii безопасны и эффективны в лечении некоторых расстройств. Так, Novelli et al. в открытом плацебо контролируемом исследовании показал профилактическое действие в отношении рецидивов респираторных инфекций при применении B. clausii у больных детей [9]. Galli et al. сообщил о эффективности B. clausii у детей с острым средним отитом [10].
Помимо того, B. clausii обладает целым рядом эффектов на организм человека, особенно на иммунную систему. Иммуномодулирующая активность проявляется специфической стимуляцией продукции секреторного IgA у людей [11] и неспецифическим усилением синтеза IFN-γ у животных [12]. Также у здоровых людей, получающих споры B. clausii, отмечено увеличение числа HLA-DR-положительных лимфоцитов как показателей Т-клеточной активности [13].
Результаты наших исследований свидетельствуют, что применение B. clausii при респираторных инфекциях у детей с аллергическими заболеваниями может оказать иммуномодулирующий эффект.
Во-первых, нормализуется соотношение Th2/Th1; усиленная выработка IL-12 стимулирует Th1, что подтверждается повышенным уровнем IFN-γ в смывах из носовой полости. Кроме того, стимулированная реакция Th1 обусловливает снижение выработки IL-4, что показано в предыдущих исследованиях [14]. Также применение B. clausii может оказывать влияние на Tr1-клетки, которое сопровождается повышением уровня TGF-β и IL-10.
В недавних исследованиях была показана способность IL-4 нарушать функцию эпителиального барьера кишечника. В то же время IL-10 и TGF-β могут уменьшить пагубное влияние IL4 на эпителий [15]. Результаты наших исследований косвенно подтверждают описанные регуляторные эффекты цитокинов Tr1-клеток (IL10 и TGF-β) в отношении цитокинов Th2 (IL4).
Наше исследование было ограничено по времени применения препарата и наблюдения, а также по количеству участвующих в нем детей.
Помимо этого, отсутствуют какие-либо данные о том, что в ходе исследования проводилось изучение вегетации спор B. сlausii, поэтому ее прямой иммуномодулирующий эффект не может считаться достоверно установленным. Наоборот, нами исследовались эффекты B. clausii на уровне органов-мишеней, таких как верхние дыхательные пути, у детей-аллергиков, анамнез которых отягощен рецидивирующими респираторными инфекциями. Концепция о рециркуляции иммунокомпетентных клеток подтверждает полученные данные, поскольку B. clausii применялся перорально.
В любом случае полученные нами результаты указывают на возможные механизмы, с помощью которых B. сlausii оказывает модулирующее действие на функционирование иммунной системы.
Однако для подтверждения этой гипотезы обязательно необходимо проведение дополнительных исследований с длительным применением препарата в больших группах детей.

Литература
1. Hatakka K., Savilahti E., Ponka A., et al. Effect of long term consumption of probiotic milk on infections in children attending day care centers: double blind, randomised trial. BMJ 2001: 322: 1-5.
2. Elson C.O., Cong Y. Understanding Immune-Microbial homeostasis in intestine. Immunol Res 2002: 26: 87-94.
3. Murch S.H. Toll of allergy reduced by probiotics. Lancet 2001: 357: 1057-9.
4. Ciprandi G., Tosca M.A. Probiotics in paediatric allergy: evidence and prospectives for Bacillus clausii. Ital J Paed Allergy Immunol 2002: 2: 49-57.
5. Riccio A.M., Tosca M.A., Cosentino C. et al. Cytokine pattern in allergic and non-allergic chronic rhinosinusitis in asthmatic children. Clin Exp Allergy 2002: 32: 422-6.
6. Kalliomaki M., Kirjavainen P., Eerola E. et al. Distinct patterns of neonatal gut microflora in infants in whom atopy was and was not developing. J Clin Allergy Immunol 2001: 107: 129-34.
7. Murch S.H. The immunologic basis for intestinal food allergy. Curr Opin Gastroenterol 2000: 16: 552-7.
8. Levings M.K., Bacchetta R., Schulz U., Roncarolo M.G. The role of Il10 and TGF-β in the differentiation and effector function of T regulatory cells. Int Arch Allergy Immunol 2002: 129: 263-76.
9. Novelli A., Ulivelli A., Reali E.F. et al. Bacillus subtilis spores as a natural pro-host oral agent. Preliminary data in children. Chemioterapia 1984: 3: 152-5.
10. Galli E., Corgiolo M., Fiore L. et al. Valutazione dialcuni parametri immunologici in bambini con otite ricorrente trattati con spore di B. subtilis. Clin Ter 1984: 109: 329-34.
11. Fiorini G., Cimminiello C., Chianese R. et al. B. subtilis selectively stimulates the synthesis of membrane bound and secreted IgA. Chemioterapia 1985: 4: 310-2.
12. Grasso G., Migliaccio P., Tanganelli C. et al. Restorative effect of B. subtilis spores on interferon production in aged mice. Pharm Aging Proc 1994: 717: 198-208.
6. Caruso A., Flamminio G., Folghera S. et al. Expression of activation markers on peripheral-blood lymphocytes following oral administration of B. subtilis spores. Int J Immunopharmacol 1993: 15: 87-92.
7. Kaur I.P., Chopra K., Saini A. Probiotics: potential pharmaceutical applications. Eur J Pharm Sci 2002: 15: 1-9.
8. Di Leo V., Yang P., Berin M.C., Perdue M.H. Factors regulating the effect of IL-4 on intestinal epithelial barrier function. Int Arch Allergy Immunol 2002: 129: 219-27.

Pediatric Allergy and Immunology, April 2004, 15 (2):148-51
(печатается с разрешения издательского дома Blackwell Publishing).

СТАТТІ ЗА ТЕМОЮ

27.03.2024 Алергія та імунологія Педіатрія Лікування алергічного риніту та кропив’янки: огляд новітнього антигістамінного препарату біластину

Поширеність і вплив алергічних захворювань часто недооцінюють [1]. Ключовим фактором алергічної відповіді є імуноглобулін (Ig) Е, присутній на поверхні тучних клітин і базофілів. Взаємодія алергену з IgЕ та його рецепторним комплексом призводить до активації цих клітин і вивільнення речовин, у тому числі гістаміну, які викликають симптоми алергії [2]. Враховуючи ключову роль гістаміну в розвитку алергічних реакцій, при багатьох алергічних станах, включаючи алергічний риніт і кропив’янку, пацієнту призначають антигістамінні препарати [3, 4]....

27.03.2024 Педіатрія 29 лютого – Всесвітній день орфанних захворювань

Рідкісні (або орфанні) захворювання є значною медико-соціальною проблемою в усьому світі. За даними EURORDIS-Rare Diseases Europe, близько 300 млн людей у світі страждають на рідкісні недуги. Попри те, що кожне окреме захворювання вражає невелику кількість людей, сукупно вони мають суттєвий вплив на систему охорони здоров’я та якість життя пацієнтів та їхніх сімей....

27.03.2024 Педіатрія Сучасні можливості для покращення якості життя у дітей з болісним прорізуванням зубів

Прорізування зубів є фізіологічним процесом і певним показником правильного чи порушеного розвитку дитини. Як фізіологічний акт, прорізування зубів не є болючим явищем і не може викликати жодних захворювань. Воно перебуває в прямому зв’язку із загальним станом здоров’я дитини, і своєчасний, у певній послідовності ріст зубів свідчить про нормальний розвиток малюка. ...

27.03.2024 Психіатрія Сучасне лікування негативних симптомів при шизофренії

У березні відбулася науково-практична конференція «Мультидисциплінарний підхід до проблемних питань неврології та психіатрії: нові стратегії лікування. Стрес-асоційовані розлади – виклики сьогодення». Захід був присвячений питанням вирішення проблем психічного та неврологічного характеру як однієї з загроз сучасного суспільства. ...