27 березня, 2015
Определение содержания цитокинов в смывах из полости носа у детей-аллергиков после применения Bacillus clausii: экспериментальное исследование
Респираторные инфекции у детей возникают очень часто. Как уже было
продемонстрировано ранее, Bacillus clausii обладает иммуномодулирующими
свойствами и безопасен в применении. Цель настоящего исследования состояла в
выяснении того, может ли применение B. clausii у детей-аллергиков с
рецидивирующими респираторными заболеваниями модулировать профиль цитокинов.
Десять детей (средний возраст 4,4 года), посещающих детский сад, были включены в
исследование по окончании учебного года (летом). Препарат, содержащий споры B.
clausii (Enterogermina®, 2 млрд спор в каждом флаконе), применялся в дозе 2
флакона в сутки на протяжении 4 нед. Определенный набор цитокинов, в том числе
интерлейкинов (IL)-1, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, интерферона
(IFN)-γ, трансформирующего фактора роста (TGF)-β и фактора некроза опухоли (TNF)-a,
определялся методом иммуноферментного анализа в смывной жидкости из полости носа
до и после лечения. Лечение с использованием B. clausii привело к существенному
снижению уровней IL-4 (p<0,01) и существенному увеличению уровней IFN-γ (p<0,05),
IL-12 (p<0,001), TGF-β (p<0,05), а также уровней IL-10 (p<0,05). Существенного
влияния на другие цитокины не отмечено. Добавим, что в данном исследовании было
продемонстрировано, что B. clausii может обладать иммуномодулирующим действием и
влиять на профиль цитокинов, выявляемых в полости носа у детей-аллергиков,
страдающих рецидивирующими респираторными инфекциями.
Респираторные инфекции у детей возникают очень часто, а их периодическое
рецидивирование создает определенные сложности для врачей-педиатров,
преимущественно в плане диагностики, выбора стратегии лечения и профилактики.
Поскольку профилактика снижает потребность в лечении, профилактическое
применение молока, содержащего пробиотики, как недавно было продемонстрировано,
смогло снизить частоту возникновения респираторных инфекций и их тяжесть у
детей, посещающих детские дошкольные учреждения [1]. Пробиотики представляют
собой микроорганизмы, оказывающие положительное влияние на здоровье «хозяина».
Взаимодействие между пробиотиком и организмом «хозяина» является достаточно
сложным и разноплановым. Происходит стимуляция иммунной системы путем
активизации иммунного ответа, опосредованного Т-хелперами 1 типа (Th1) и
Т-регулирующими клетками (Tr1), а также снижения активности
Т-хелперов 2 типа (Th2) [2]. У детей, страдающих аллергией, отмечается
поляризация иммунного ответа в сторону Th2, для которой характерны высокие
уровни интерлейкина (IL)-4 и низкие – интерферона (IFN)-γ [3]. Поэтому
пробиотики вполне могут считаться важным терапевтическим достижением в деле
профилактики инфекций и атопии.
В этом отношении Bacillus clausii – безопасный и часто назначаемый пробиотик. В
опубликованном недавно обзоре были представлены данные некоторых исследований,
указывающие на его роль в профилактике инфекций желудочно-кишечного тракта у
детей и модулировании иммунного ответа [4].
Поэтому наша цель состояла в изучении потенциального влияния B. clausii на
профиль цитокинов, в том числе IL-1, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12,
IFN-γ, трансформирующего фактора роста (TGF)-β и фактора некроза опухоли (TNF)-α,
у детей-аллергиков, страдающих рецидивирующими респираторными инфекциями.
Материалы и методы
Субъекты исследования. Оценка проводилась среди десяти детей, посещающих
дошкольное учреждение. У каждого пациента проводился тщательный сбор
клинического анамнеза, а также физикальное и аллергологическое обследование.
Демографические данные представлены в таблице.
Дизайн исследования. Для оценки профиля цитокинов в исследование была включена
группа из 10 детей с диагностированной аллергией, у которых периодически
возникали рецидивы респираторных инфекций. Диагноз аллергии ставился на
основании клинического анамнеза, физикального обследования, а также кожной пробы
накалыванием (прик-теста) с обычным набором аллергенов, описанной в различных
источниках [5]. Рецидивирование респираторных инфекций определялось произвольным
образом как 6 случаев инфекции в год. В исследование не включались дети, на
протяжении предшествующих 4 нед принимавшие антигистамины, а также
кортикостероиды для назального, ингаляционного и перорального использования.
Группа плацебо не была предусмотрена, так как основная цель исследования
состояла в оценке иммунопатологических явлений, возникающих после приема B.
clausii. В любом случае исследование было слепым для исследователя, проводившего
определение содержания цитокинов.
Все дети перорально получали препарат, содержащий споры B. clausii (Enterogermina®;
Sanofi-Synthelabo OTC, Милан, Италия – 2 млрд спор в каждом флаконе), в дозе 2
флакона в сутки на протяжении 4 нед. Исследование проводилось по окончании
учебного года, летом, поскольку в этот период частота возникновения
респираторных инфекций в нашей зоне является очень низкой.
Взятие смывов из полости носа проводилось у всех испытуемых до и непосредственно
после применения B. clausii.
Исследование было одобрено Экспертным советом медицинского учреждения. От
родителей было получено устное информированное согласие на участие их детей в
исследовании.
Смывы из носа. Взятие смывов из полости носа проводилось с использованием 5 мл
физиологического раствора хлорида натрия в соответствии со стандартной
методикой, описанной во многих источниках [5]. Во время проведения манипуляции
голова пациента была отклонена назад, при этом мягкое небо закрывало вход в
глотку. Полученная жидкость была сопоставимой у всех субъектов исследования; ее
собирали для определения уровней содержания цитокинов и хранили при температуре
-20° C [5].
Оценка содержания цитокинов. Содержание цитокинов измерялось с методом ELISA –
твердофазного иммуноферментного анализа (R&D Systems, США). При проведении
анализа использовали количественную методику иммуноферментного сэндвич-анализа.
Эта методика широко описана в различных публикациях [5].
Статистический анализ. Был проведен статистический анализ полученных данных с
использованием многовариационного дисперсного анализа (M-ANOVA) и апостериорного
сравнения с помощью теста Дункана. Соотношение Th2/Th1 рассчитывалось с помощью
t-теста. Результаты, для которых значения p были меньше 0,05, считались
статистически достоверными.
Результаты
У детей, принимавших назначенный препарат, содержащий споры B. сlausii,
какие-либо побочные явления не наблюдались. Ниже приведен профиль цитокинов до и
после лечения B. clausii.
После лечения уровни IL-4 значительно снизились (p<0,001; средние исходные
показатели 4,49±1,45 стандартного отклонения (СО) и средние показатели после
лечения 3,52±0,9 СО). При приеме Bacillus clausii значительно повысились уровни
IFN-γ (p<0,05; средние исходные показатели 1,81±0,79 СО и средние показатели
после лечения 2,65±0,69 СО) и IL-12 (p<0,001; средние исходные показатели
0,76±0,43 СО и средние показатели после лечения 1,36±0,81 СО). Под действием B.
сlausii существенно возросли уровни TGF-β (p<0,05; средние исходные показатели
0,9±0,34 СО и средние показатели после лечения 1,33±0,51 СО), а также уровни
IL-10 (p<0,05; средние исходные показатели 1,45±0,75 СО и средние показатели
после лечения 2,05±0,72 СО).
Соотношение Th2/Th1 (IL-4/IFN-γ) существенно сократилось с 2,92±1,71 до лечения
до 1,44±0,57 после лечения (p=0,018).
B. clausii не оказывал существенного влияния на другие изучаемые цитокины –
IL-1, IL-3, IL-6 и IL-8 (данные не представлены).
Обсуждение
Высокая частота острых респираторных инфекций у детей является значительным
бременем как для общества в целом, так и для каждой семьи.
У детей с аллергическими заболеваниями отмечается преобладание Th2 [3].
Известно, что цитокины Th2-клеток играют ведущую роль в развитии аллергического
воспаления. Сегодня появляется все больше доказательств ключевого значения
цитокина Th1 – IFN-γ – в прерывании развившейся аллергической реакции [6].
Пробиотики могут стимулировать иммунный ответ слизистых оболочек и активировать
потенциальные антиаллергические и противовоспалительные процессы: Th1 иммунитет,
контррегуляторный Tr1 иммунный ответ и синтез иммуноглобулина (IgA) [2]. Таким
образом, способность пробиотиков восстанавливать иммунологические процессы,
смещенные в сторону Th2, может стать значительным прогрессом в профилактике
инфекции и атопии у детей.
Точные механизмы влияния пробиотиков на иммунный ответ еще изучаются. Однако в
настоящее время появляется все больше доказательств необходимости специфического
влияния кишечной флоры на иммунную систему в развитии и поддержании
иммунотолерантности слизистых оболочек [7]. В частности, толерантность слизистой
оболочки ротовой полости во многом зависит от подавления потенциальной
реактивности лимфоцитов. Также было показано, что недавно изученные Tr1-клетки,
вырабатывающие TGF-β и IL-10, вызывают уменьшение воспалительной реакции
слизистой оболочки [8].
В исследованиях было установлено, что споры Bacillus clausii безопасны и
эффективны в лечении некоторых расстройств. Так, Novelli et al. в открытом
плацебо контролируемом исследовании показал профилактическое действие в
отношении рецидивов респираторных инфекций при применении B. clausii у больных
детей [9]. Galli et al. сообщил о эффективности B. clausii у детей с острым
средним отитом [10].
Помимо того, B. clausii обладает целым рядом эффектов на организм человека,
особенно на иммунную систему. Иммуномодулирующая активность проявляется
специфической стимуляцией продукции секреторного IgA у людей [11] и
неспецифическим усилением синтеза IFN-γ у животных [12]. Также у здоровых людей,
получающих споры B. clausii, отмечено увеличение числа HLA-DR-положительных
лимфоцитов как показателей Т-клеточной активности [13].
Результаты наших исследований свидетельствуют, что применение B. clausii при
респираторных инфекциях у детей с аллергическими заболеваниями может оказать
иммуномодулирующий эффект.
Во-первых, нормализуется соотношение Th2/Th1; усиленная выработка IL-12
стимулирует Th1, что подтверждается повышенным уровнем IFN-γ в смывах из носовой
полости. Кроме того, стимулированная реакция Th1 обусловливает снижение
выработки IL-4, что показано в предыдущих исследованиях [14]. Также применение
B. clausii может оказывать влияние на Tr1-клетки, которое сопровождается
повышением уровня TGF-β и IL-10.
В недавних исследованиях была показана способность IL-4 нарушать функцию
эпителиального барьера кишечника. В то же время IL-10 и TGF-β могут уменьшить
пагубное влияние IL4 на эпителий [15]. Результаты наших исследований косвенно
подтверждают описанные регуляторные эффекты цитокинов Tr1-клеток (IL10 и TGF-β)
в отношении цитокинов Th2 (IL4).
Наше исследование было ограничено по времени применения препарата и наблюдения,
а также по количеству участвующих в нем детей.
Помимо этого, отсутствуют какие-либо данные о том, что в ходе исследования
проводилось изучение вегетации спор B. сlausii, поэтому ее прямой
иммуномодулирующий эффект не может считаться достоверно установленным. Наоборот,
нами исследовались эффекты B. clausii на уровне органов-мишеней, таких как
верхние дыхательные пути, у детей-аллергиков, анамнез которых отягощен
рецидивирующими респираторными инфекциями. Концепция о рециркуляции
иммунокомпетентных клеток подтверждает полученные данные, поскольку B. clausii
применялся перорально.
В любом случае полученные нами результаты указывают на возможные механизмы, с
помощью которых B. сlausii оказывает модулирующее действие на функционирование
иммунной системы.
Однако для подтверждения этой гипотезы обязательно необходимо проведение
дополнительных исследований с длительным применением препарата в больших группах
детей.
Литература
1. Hatakka K., Savilahti E., Ponka A., et al. Effect of long term consumption of
probiotic milk on infections in children attending day care centers: double
blind, randomised trial. BMJ 2001: 322: 1-5.
2. Elson C.O., Cong Y. Understanding Immune-Microbial homeostasis in intestine.
Immunol Res 2002: 26: 87-94.
3. Murch S.H. Toll of allergy reduced by probiotics. Lancet 2001: 357: 1057-9.
4. Ciprandi G., Tosca M.A. Probiotics in paediatric allergy: evidence and
prospectives for Bacillus clausii. Ital J Paed Allergy Immunol 2002: 2: 49-57.
5. Riccio A.M., Tosca M.A., Cosentino C. et al. Cytokine pattern in allergic and
non-allergic chronic rhinosinusitis in asthmatic children. Clin Exp Allergy
2002: 32: 422-6.
6. Kalliomaki M., Kirjavainen P., Eerola E. et al. Distinct patterns of neonatal
gut microflora in infants in whom atopy was and was not developing. J Clin
Allergy Immunol 2001: 107: 129-34.
7. Murch S.H. The immunologic basis for intestinal food allergy. Curr Opin
Gastroenterol 2000: 16: 552-7.
8. Levings M.K., Bacchetta R., Schulz U., Roncarolo M.G. The role of Il10 and
TGF-β in the differentiation and effector function of T regulatory cells. Int
Arch Allergy Immunol 2002: 129: 263-76.
9. Novelli A., Ulivelli A., Reali E.F. et al. Bacillus subtilis spores as a
natural pro-host oral agent. Preliminary data in children. Chemioterapia 1984:
3: 152-5.
10. Galli E., Corgiolo M., Fiore L. et al. Valutazione dialcuni parametri
immunologici in bambini con otite ricorrente trattati con spore di B. subtilis.
Clin Ter 1984: 109: 329-34.
11. Fiorini G., Cimminiello C., Chianese R. et al. B. subtilis selectively
stimulates the synthesis of membrane bound and secreted IgA. Chemioterapia 1985:
4: 310-2.
12. Grasso G., Migliaccio P., Tanganelli C. et al. Restorative effect of B.
subtilis spores on interferon production in aged mice. Pharm Aging Proc 1994:
717: 198-208.
6. Caruso A., Flamminio G., Folghera S. et al. Expression of activation markers
on peripheral-blood lymphocytes following oral administration of B. subtilis
spores. Int J Immunopharmacol 1993: 15: 87-92.
7. Kaur I.P., Chopra K., Saini A. Probiotics: potential pharmaceutical
applications. Eur J Pharm Sci 2002: 15: 1-9.
8. Di Leo V., Yang P., Berin M.C., Perdue M.H. Factors regulating the effect of
IL-4 on intestinal epithelial barrier function. Int Arch Allergy Immunol 2002:
129: 219-27.
Pediatric Allergy and Immunology, April 2004, 15 (2):148-51
(печатается с разрешения издательского дома Blackwell Publishing).