27 березня, 2015
Особенности организации преаналитического этапа лабораторного анализа
(Продолжение. Начало в № 18.)
Получение биологического материала для исследования
Под биологическим материалом подразумевается любой образец клеток, ткани или биологической жидкости, полученный от пациента. Это могут быть кровь, моча, ликвор, слюна, соскоб слизистых оболочек, биоптат, экссудат, транссудат и так далее. Для каждого из образцов существуют свои способы и особенности получения, определяемые как видом самого материала, так и предстоящим исследованием (цитологическое, биохимическое и т. д.).
Наиболее распространенным клиническим материалом для лабораторного анализа является кровь. В зависимости от цели исследования, требований методики и клинической ситуации анализу может подвергаться как цельная кровь, так и ее компоненты: сыворотка, плазма либо клетки крови, полученные из капиллярной, венозной, иногда артериальной крови. Для большинства лабораторных исследований используется венозная кровь.
Факторы, влияющие на качество лабораторного анализа на этапе получения образца крови:
· время взятия крови;
· материал пробирок (систем для взятия крови) и стабилизирующие добавки;
· соблюдение соотношения крови и антикоагулянта;
· очередность наполнения пробирок с различными добавками;
· длительность наложения жгута;
· положение тела пациента во время процедуры;
· квалификация персонала, проводящего венепункцию.
Для большинства исследований пробы крови следует брать с 7 до 10 часов утра. Во-первых, такое время наилучшим образом гарантирует необходимый период воздержания от принятия пищи (12-14 часов). Во-вторых, для большинства тестов референтные интервалы (старый термин – «диапазон нормальных значений») разработаны на основании исследования образцов, полученных именно в это время суток. В-третьих, для многих аналитов (железо, ТТГ, паратгормон) отмечается существенное изменение концентраций после 10 часов. При повторных обследованиях пациента для более корректного сравнения полученных результатов пробы необходимо получать в одно и то же время, что проще реализовать при ограничении времени сдачи крови периодом с 7 до 10 часов. В бланке направления всегда следует отмечать точное время взятия пробы, это является важным условием для правильной интерпретации результата при проведении лекарственного мониторинга, а также последующего контроля хранения и транспортировки полученных образцов.
Существенное влияние на результат теста оказывает материал контейнеров (пробирок) для взятия и хранения биоматериала. Взаимодействие компонентов крови со стеклянной либо пластмассовой поверхностью стенки пробирки определяет различия в формировании сгустка; материал пробирки может выделять вещества в образец или адсорбировать из него аналиты. Например, при сборе суточной мочи на стенках стеклянной и пластиковой посуды происходит адсорбция альбумина, что приводит к занижению результатов при его определении. Кроме того, известен ряд химических веществ, входящих в состав пробирок, смещающих показатели иммунохимических тестов (используются при определении гормонов, онкомаркеров) в ту или иную сторону.
В зависимости от назначенного вида исследования образец крови должен собираться в присутствии строго определенных добавок. Для исследований системы свертывания крови применяется только цитратная плазма. В большинстве гематологических исследований используется венозная кровь с натриевой солью ЭДТА. Для получения сыворотки кровь собирают без антикоагулянтов, а для исследования глюкозы – с добавлением ингибиторов гликолиза (фтористого натрия или йодацетата). Для определения нестабильных аналитов (АКТГ, паратгормон, инсулин, С-реактивный белок) используют пробирки с разделительным гелем.
В большинстве лечебно-профилактических учреждений Украины для взятия крови используются вакуумные системы забора крови. Они имеют цветовую маркировку в зависимости от содержащихся в них консервантов, разделительных гелей или активаторов свертывания. При использовании вакуумных систем забора крови обеспечивается точное соотношение антикоагулянта и крови, что ведет к получению более точного результата исследования. Кроме того, поскольку вакуумные системы являются одновременно контейнером для хранения и транспортировки крови, их использование предотвращает повреждение форменных элементов, что часто происходит при взятии крови одноразовым шприцем и разливании ее по пробиркам.
За последние несколько лет появились публикации, касающиеся интерферирующего влияния материала пробирок и веществ, входящих в состав разделительных гелей, на определение многих гормонов и онкомаркеров. Научная общественность и производители вакуумных систем активно работают в этом направлении. К сожалению, в инструкциях по применению, технических бюллетенях и даже в патентах не приводится необходимой информации о составе и свойствах всех добавок. Действующие международные стандарты, определяющие требования и методы контроля производства устройств для забора крови, не требуют исследований влияния добавок на иммунохимический анализ. Для исключения ошибок лабораторного анализа, связанных с влиянием материала пробирок и добавок, сотрудники лабораторий должны хорошо знать причины и механизмы этого вида интерференции и проявлять повышенное внимание при смене лота, вида, типа или производителя систем забора крови. Общепринятый аналитический внутрилабораторный контроль качества с использованием контрольных материалов в данном случае не может выявить ошибки исследований.
Одним из немаловажных требований к процедуре взятия крови является соблюдение определенной последовательности наполнения пробирок с различными добавками для различных видов исследований. Так, для исследования системы гемостаза необходимым условием является предотвращение попадания в пробу тканевого тромбопластина из места венепункции, поэтому если должна быть набрана только пробирка с цитратом натрия, первые несколько мл крови (2-3) следует отобрать в пустую пробирку и утилизировать. На сегодня в крупных медицинских центрах осуществляется концепция комплексного лабораторного обследования, когда пациент сдает кровь для большого количества тестов, как правило, в пробирки с различными наполнителями. Очередность наполнения пробирок определяется перечнем исследований и видом добавок, но специалисты рекомендуют придерживаться такой последовательности:
· кровь для микробиологического исследования;
· цельная нативная кровь (без антикоагулянтов);
· цитратная кровь;
· кровь с ЭДТА, гепарином;
· кровь с ингибиторами гликолиза.
Важным фактором, влияющим на концентрацию многих компонентов крови в образце, является длительность наложения венозного жгута. Длительное сдавливание вены приводит к гемоконцентрации в месте взятия крови, что существенно изменяет содержание многих аналитов. Выбор оптимальной продолжительности наложения жгута (2 мин) обоснован исследованиями, результаты которых представлены в таблице. Согласно приведенным результатам, значения показателей в пробах крови, взятых спустя 4 и 6 мин после наложения жгута, в значительной степени отличаются от результатов анализов, взятых через 0 и 2 мин. Этот временной критерий представлен и в международных стандартах (NCCLS:H4-A3, 1991). Достаточно чувствительными к длительному наложению жгута являются и такие аналиты, как калий, кальций, магний, ЛПВП, ЛДГ, гематокрит и др. К гемоконцентрации также приводят массаж и сжимание в месте взятия крови, склерозированные или окклюзированные вены у пациента.
В последнее время большое внимание уделяется положению тела пациента в момент взятия крови. Это связано с тем, что для некоторых аналитов определены существенные различия в концентрациях в зависимости от положения тела пациента. Так, например, общий белок и кальций демонстрируют разницу концентраций около 10% при заборе крови в положениях лежа и сидя. Зависимость содержания вещества в образце от положения тела обнаружены в отношении альдостерона, липопротеина (а), С-реактивного белка. Четких рекомендаций относительно положения тела пациента в момент взятия крови пока не существует, однако желательно придерживаться принципа воспроизводимости условий взятия крови (либо лежа, либо сидя), что позволит корректно сравнивать результаты анализов в динамике.
Очень важно, особенно при обследовании пациентов, находящихся в палате интенсивной терапии или операционной, соблюдать важное правило: никогда не брать кровь из вены, в которую вводят лекарства и растворы. Кроме того, даже при заборе крови из другой руки следует учитывать расписание уже проведенных инфузий. Так, кровь можно брать только через 8 ч после введения жировых эмульсий и через 1 ч после введения аминокислот, гидролизатов белков, электролитов или растворов с высоким содержанием углеводов.
Одним из серьезных факторов, влияющих на качество определения многих аналитов в пробе крови, является гемолиз. Он может быть спровоцирован погрешностями как во время процедуры взятия крови, так и на этапе хранения и транспортировки образца. Гемолиз – высвобождение внутриклеточных компонентов из клеток крови в плазму или сыворотку. Наличие гемолиза распознают по появлению красноватого окрашивания плазмы или сыворотки крови после центрифугирования, что связано с высвобождением гемоглобина из эритроцитов. Интерференция может возникнуть даже при низких концентрациях гемоглобина, не различимых невооруженным глазом. Гемолиз не всегда сопровождается высвобождением гемоглобина. Кроме того, источники интерференции могут возникнуть при лизисе тромбоцитов и гранулоцитов.
Основные причины гемолиза:
· слишком тонкая игла для венепункции;
· очень быстрые движения поршня при заборе крови шприцем;
· неаккуратное (быстрое) переливание крови из одной емкости в другую;
· попадание воды в пробирку с кровью;
· очень интенсивное перемешивание (встряхивание);
· длительное (более 2 мин) наложение жгута;
· патология мембран эритроцитов.
Наличие явных признаков гемолиза является критерием отказа при выполнении таких биохимических и серологических тестов, как АЛТ, АСТ, билирубин, эритропоэтин, ревматоидный фактор, калий, магний, железо, креатинкиназа, креатинин и др.
Таким образом, сама процедура получения биоматериала для исследования также может стать источником разнообразных погрешностей и внести свой вклад в общую ошибку результата лабораторного анализа. Для минимизации возможных отклонений в результатах необходимо строго придерживаться инструкций по подготовке пациента и непосредственно самой процедуре получения крови, разработанных специалистами лабораторной службы. К сожалению, персонал процедурных кабинетов иногда не представляет себе последствий нарушения регламента получения биоматериала.
Транспортировка и хранение образцов до исследования
Требования к хранению и транспортировке биоматериала определяются стабильностью (устойчивостью) компонентов пробы. Устойчивость – это время, в течение которого первоначальное содержание (концентрация, активность и т. д.) аналита в пробе не изменится при хранении в строго определенных условиях. Наиболее важные причины, влияющие на стабильность компонентов пробы и, соответственно, качество образца:
· метаболизм клеток крови;
· испарение/сублимация;
· химические реакции;
· разрушение микроорганизмами;
· осмотические процессы;
· воздействие света;
· диффузия газов.
Применение закрытых вакуумных систем для взятия и хранения крови с различными добавками и стабилизаторами решает большинство из перечисленных проблем. Например, при взятии крови для определения глюкозы без антигликолитических стабилизаторов приводит к тому, что уже через час хранения при комнатной температуре концентрация глюкозы в образце снижается на 0,275-0,55 ммоль/ч. Использование пробирок, содержащих ингибиторы гликолиза, увеличивает время стабильности глюкозы в образце до 2 суток. Время и температура – два основных фактора, воздействующих на компоненты образца с момента его получения до поступления в лабораторию. Общим правилом для большинства аналитов является отделение сыворотки (плазмы) от форменных элементов крови в течение получаса-часа от момента получения. Использование пробирок с разделительным гелем и центрифугирование пробы непосредственно после забора крови позволяют увеличить длительность хранения пробы до отправки в лабораторию. Температура <4 °С и >30 °С может существенно изменить содержание в образце многих веществ. Как правило, основная часть компонентов крови более стабильна при температуре +4-8 °С, однако есть и исключения. Например, если в плазме необходимо определить АЧТВ (и некоторые другие показатели гемостаза), следует избегать охлаждения пробы из-за возможной инактивации фактора VII. Эффект высвобождения калия из эритроцитов и повышения содержания его в сыворотке усиливается при температуре ниже +4 °С и выше +30 °С, тогда как при комнатной температуре он минимален вследствие температурной зависимости активности
Na+/K+-АТФазы. Пробы крови, отобранные для определения АКТГ, кальцитонина, С-пептида и некоторых других нестабильных аналитов, после разделения должны быть немедленно помещены на лед.
В процессе хранения и транспортировки проб крови существенное влияние на стабильность аналитов оказывают свет и сильная вибрация. Неосторожное обращение с контейнерами с кровью (сильная тряска, удары) может привести к гемолизу, влияние которого рассмотрено выше. Под воздействием прямого солнечного света в образце разрушаются билирубин, уробилиноген (в моче), снижается концентрация рибофлавина, ретинола, токоферола и некоторых других витаминов.
На этапе получения, хранения и транспортировки биоматериала в рамках внутрилабораторной оценки качества контролю подлежат время взятия материала, правильный выбор типа пробирки (антикоагулянт, стабилизатор), время отделения форменных элементов, длительность и условия хранения образца, время доставки материала в лабораторию, целостность контейнера с образцом, соблюдение соотношения крови и антикоагулянта, соответствие маркировки на пробирке данным бланка-направления. В каждой лаборатории должны быть разработаны так называемые критерии отказа – условия, при которых материал на исследование не принимается (нарушено соотношение кровь/антикоагулянт, несоответствие маркировки данным направления, нарушение герметичности пробирок с образцами для определения газов крови, выраженный гемолиз и т. д). Каждый случай отказа с указанием его причины должен фиксироваться в соответствующем журнале.
Лабораторная часть преаналитического этапа включает организацию приема проб и заявок на исследование, регистрацию проб и пациентов, центрифугирование (если необходимо), условия и сроки хранения проб до анализа, выявление влияний (гемолиз, липемия, желтушность) и примесей (метаболиты лекарств, загрязнения), деление проб и формирование вторичных пробирок, распределение проб по рабочим местам, загрузка пробирок в анализаторы.
Таким образом, при осуществлении контроля качества лабораторных исследований на преаналитическом этапе необходимо стандартизировать основные процедуры и соблюдать ряд общих требований:
· применение современных систем взятия материала, имеющих все необходимые сертификаты качества и использование их в строгом соответствии с инструкциями производителей;
· правильная подготовка пациента к исследованию;
· соблюдение условий получения биоматериала для анализа;
· четкий регламент процедуры получения биоматериала;
· соблюдение условий хранения и транспортировки образцов;
· соблюдение условий первичной обработки проб и хранения до исследования;
· обеспечение безопасности персонала и комфортных условий работы.
Соблюдение правил преаналитического этапа – необходимое условие для стандартизации результатов лабораторного исследования в целом. К сожалению, в то время как на аналитическом этапе лабораторного анализа количество операций непосредственно во время исследования минимально, а средства контроля качества наиболее развиты и реально применяются в практике современных лабораторий, для преанатического этапа такие меры контроля не разработаны.
Подготовила Александра Яковец