27 березня, 2015
Папилломавирусная инфекция: проблемы диагностики
По данным Международного агентства по изучению рака ВОЗ, рак шейки матки (РШМ) – одно из наиболее распространенных онкологических заболеваний, занимающее второе место по частоте встречаемости среди женщин во всем мире, уступая только раку молочной железы. Ежегодно в мире диагностируется около 500 тыс. случаев заболеваний и 250 тыс. пациентов умирают. На сегодня доказана безусловная роль папилломавирусов в развитии РШМ и других злокачественных новообразований урогенитального тракта.
Одним из первых и основных методов диагностики предраковых поражений стал цитологический анализ мазка. Однако он является субъективным методом и зависит от квалификации врача. Вследствие этого программы цитологического скрининга не сумели существенно уменьшить частоту развития РШМ. Международное агентство по изучению рака ВОЗ рекомендует включать в программы популяционного скрининга молекулярные тесты для выявления вируса папилломы человека.
Вирусы папилломы человека (ВПЧ) являются самыми мелкими ДНК-содержащими вирусами. Размер их вирионов колеблется от 30 до 50 нм, капсид обладает икосаэдральной симметрией и состоит из 72 капсомеров. Вирусы содержат капсидные белки трех типов, которые являются типоспецифическими антигенами. ДНК папилломавирусов замкнутая, кольцевая, состоит из примерно 8000 пар нуклеотидов и имеет «раннюю» и «позднюю» области. В составе последней идентифицировано два гена (L1 и L2), которые кодируют белки вириона. Ранние белки контролируют репликацию вируса, транскрипцию и клеточную трансформацию. Среди ранних генов два (Е6 и Е7) регулярно выявляются в большинстве опухолей, ассоциированных с ВПЧ.
Вирусная ДНК может присутствовать в клетках, трансформированных папилломавирусами, в виде эписом и ассоциирована с клеточными гистонами. Это одна из особенностей папилломавирусов, отличающая их от других онкогенных вирусов, которые, как известно, всегда встраивают свой геном в хромосомную ДНК трансформированной клетки. Другое интересное свойство папилломавирусов заключается в том, что состояние дифференцирования клетки-хозяина регулирует экспрессию вирусного генома.
На ранних стадиях инфицирования вирус находится в эписомальной форме, поэтому клетка способна продуцировать вирусные частицы. На более поздних стадиях вирусный геном интегрирует в клеточный, и способность к репродукции утрачивается. Интеграция вируса в клеточный геном сопровождается частичной утратой вирусного генетического материала, но с обязательным сохранением генов Е6 и Е7.
Существуют данные о несомненном трансформирующем действии этих двух функциональных генов папилломавирусов, которые изучены в основном на модели ВПЧ-16. Продукты обоих генов независимо друг от друга способны к иммортализации кератиноцитов человека, а в комбинации – повышают эффективность иммортализации. Продукт гена Е6 способен взаимодействовать с белком р53 в системах in vitro, подавляя супрессорную функцию последнего. Опухолевый супрессор р53 играет важную роль, предотвращая размножение и накопление в организме аномальных клеток. В основе такой функции белка р53 лежит его способность активироваться при самых разных внутриклеточных нарушениях и вызывать в ответ на них либо экстренную остановку клеточного цикла в
G1- и G2-фазах, либо апоптоз. Активация р53 наблюдается при различных ДНК-повреждающих воздействиях (УФ- и
γ-облучение, химические мутагены), снижении внутриклеточного пула нуклеотидов, ингибировании ДНК- и РНК-полимераз, разрушении цитоскелета (микротрубочек и актиновых микрофиламентов), нарушениях контактов клеток с внеклеточным матриксом, гипоксии, тепловом и холодовом шоках, а также при экспрессии некоторых клеточных или вирусных онкогенов. Нарушение функции гена р53 приводит к инактивации «контрольных точек» (checkpoints) в
G1- и G2-фазах клеточного цикла, увеличению жизнеспособности поврежденных клеток и, как следствие, к значительному увеличению скорости накопления в организме клеток с различными изменениями генома, в том числе и онкогенными. О важной роли нарушений функции белка р53 в процессах канцерогенеза свидетельствует тот факт, что примерно в половине всех опухолей человека обнаруживаются мутации гена р53.
Продукты гена Е7 ВПЧ сами по себе способны к иммортализации первичных клеток грызунов, а в сочетании с продуктом активированного гена ретинобластомы (Rb105) – к их трансформации. Известно, что продукты генов Е7 ВПЧ типов 16 и 18 индуцируют трансформацию стабильных клеточных линий фибробластов грызунов.
Помимо трансформирующего онкогенного действия, длительно персистирующие в организме ВПЧ могут обусловливать повреждение иммунной системы, которое в дальнейшем приводит к нарушению равновесия между Т-хелперами и Т-супрессорами, а также к снижению количества естественных киллерных клеток. Можно считать доказанной супрессорную роль ВПЧ в процессе формирования различных вариантов экзофитных образований и плоских кондилом, и, наоборот, появление плоских папиллом при проведении иммуносупрессивной терапии больным с аллотрансплантантом почки можно расценивать как маркер снижения иммунного статуса пациентов. Также обнаружено возникновение транзиторного иммунодефицита у беременных, который проявляется активной экспрессией ВПЧ с образованием множественных папиллярных разрастаний в перианальной и вагинальной областях половых органов.
С помощью молекулярно-биологических методов уже идентифицировано около 200 генотипов ВПЧ, причем для некоторых типов вируса известны как «дикие», так и мутантные разновидности. Различаются генотипы папилломавирусов по степени гомологичности ДНК. С поражением урогенитального тракта исследователи ассоциируют 35 типов ВПЧ. По мере изучения ВПЧ выяснилось, что риск злокачественного перерождения связан с несколькими типами ВПЧ (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 54, 56, 58, 59, 66, 68), которые обозначены как вирусы высокого онкогенного риска.
Отмечено, что тип 16 наиболее часто встречается в тканях плоскоклеточного рака шейки матки, а тип 18 – в ткани железистого рака – аденокарциномы. Перечень типов ВПЧ онкогенного риска расширяется за счет уточнения строения ДНК и появления новых типов промежуточного риска. Вирусами низкого риска считаются 5 типов ВПЧ: 6, 11, 42, 43, 44.
Достаточно давно было замечено, что эпидемиология рака мочеполовых путей человека схожа с таковой венерических заболеваний. В настоящее время известно, что папилломавирусная инфекция передается преимущественно половым (с инфицированием сексуальных партнеров в 60%) и контактно-бытовым путем, а также при проведении медицинских исследований, при прохождении плода через инфицированные родовые пути (с этим путем передачи связывают ювенильный папилломатоз гортани и рецидивирующий респираторный папилломатоз с кистозом легких у детей).
Инфицированность населения ВПЧ, по различным данным, составляет от 40 до 60%. Максимальная заболеваемость, обусловленная ВПЧ, наблюдается в возрасте от 18 до 28 лет. Однако и в старших группах в силу возрастных изменений иммунитета и гормональных функций организма, которые благоприятствуют многим факторам канцерогенеза, возможны проявления папилломавирусной инфекции и клеточная трансформация ракового характера.
По современным данным, факторами риска развития цервикальной неоплазии и РШМ являются длительность персистенции вируса, генотип ВПЧ, возраст женщины, уровень эстрогенов и состояние иммунной системы. Женщины, у которых длительно персистирует ВПЧ в шейке матки, по сравнению с теми, у которых нет этого вируса, имеют высокий риск (примерно 65-кратный) развития РШМ. Более высокий риск (130-кратный) отмечается у женщин старше 30 лет, инфицированных типами ВПЧ высокого онкогенного риска, включая в первую очередь типы 16 и 18. При клинически установленном РШМ ВПЧ современными методами исследования обнаруживается во всех случаях.
Папилломавирусная инфекция поражает как женщин, так и мужчин, однако в силу гормональных различий вероятность развития опухолей у мужчин гораздо ниже, чем у женщин. Тем не менее мужчины в течение длительного времени могут быть носителями ВПЧ и передать его более уязвимой популяции – женщинам.
Многочисленные исследования указывают на возможность спонтанной регрессии папилломавирусной инфекции, то есть на самопроизвольное выздоровление. В 85% случаев через год после инфицирования папилломавирус исчезает из организма вследствие действия иммунных сил. Однако элиминация ВПЧ из организма не исключает возможности передачи его партнеру во время персистенции вируса в период так называемой латентной инфекции, поэтому информация о носительстве папилломавирусов с эпидемиологической точки зрения не менее важна, чем с клинической.
Таким образом, высокая контагиозность и способность к онкогенному действию – два основных фактора патогенности папилломавирусов. Раннее выявление ВПЧ с целью своевременного определения пациента в группу риска и наблюдения за ним должно стать основным мероприятием по профилактике РШМ и других новообразований, ассоциированных с ВПЧ.
Цитологический скрининг является важным звеном в диагностике неоплазий, вызванных ВПЧ, однако молекулярно-биологические методы диагностики наиболее чувствительны на ранних этапах папилломавирусной инфекции, когда отсутствуют клинические, кольпоскопические и цитологические признаки инфицирования ВПЧ.
Для идентификации ВПЧ в биологическом материале сегодня используют такие методы, как гибридизация in situ, полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция, система двойной гибридной ловушки (Digene Hybrid Capture System). Метод гибридизации in situ осуществляется на гистологических срезах, поэтому для скрининговых исследований не пригоден. Хорошей аналитической чувствительностью и специфичностью обладает Digene Hybrid Capture System, однако в настоящее время она не получила широкого распространения из-за своей дороговизны. В нашей стране наиболее популярной является ПЦР – малоинвазивный амплификационный метод детекции, заслуживший доверие как лаборантов, так и клиницистов.
Материалом для исследования служат соскоб клеток слизистых оболочек урогенитального тракта или осадок мочи. Кровь на ВПЧ методом ПЦР не исследуют. Важным моментом является правильное взятие материала для исследования. Клеточный материал необходимо получить без слизи и, желательно, без крови. При наличии клинических или субклинических признаков папилломавирусной инфекции (экзофитный, эндофитный рост) и неоплазий соскоб необходимо брать со всех пораженных участков. Нельзя исследовать клеточный материал, полученный после обработки шейки матки уксусной кислотой или раствором Люголя. Также необходимо придерживаться остальных правил подготовки пациента, взятия и хранения материала для ПЦР-исследования.
В большинстве лабораторий Украины для выявления ВПЧ используются хорошо зарекомендовавшие себя тест-системы для ПЦР российского производства. Тест-системы для скрининга позволяют выявить в клеточном материале 14 типов ВПЧ высокого онкогенного риска и 5 типов низкоонкогенного, однако скрининговое исследование не дает информации о наличии конкретного генотипа, количестве вирусов, присутствии нескольких типов одновременно. Тест-система для генотипирования вирусов высокого риска идентифицирует 12 типов ВПЧ, что позволяет прогностически оценить возможность клеточной трансформации у инфицированных лиц. Как известно, наиболее агрессивным канцерогенным потенциалом обладают 16, 18, 31, 33, 35 генотипы ВПЧ. Помимо этого, персистенция в клетках более чем одного типа вируса папилломы также свидетельствует о неблагоприятном прогнозе.
Согласно недавним исследованиям, папилломавирусная инфекция обладает дозозависимым эффектом – при высокой концентрации ДНК ВПЧ в материале риск развития неоплазии и опухоли более высокий. В связи с этим важное значение для прогноза течения ВПЧ-инфекции имеет определение вирусной нагрузки. Выявление вируса в количестве не ниже определенного порогового уровня (порога клинической значимости) имеет низкое клиническое значение, так как говорит о высокой вероятности спонтанного излечения и практически полном отсутствии риска прогрессии. Однако для скрининга этот порог обязателен к использованию: положительными учитываются только случаи вирусной нагрузки, превышающей порог. Напротив, для послеоперационного мониторинга выявление вируса даже с низкой нагрузкой может быть ранним маркером рецидива, поэтому введение порога в этом случае не оправдано.
Российские ученые разработали количественную методику определения нагрузки ВПЧ на основе ПЦР в реальном времени, на основе которой определили пороговый уровень клинически значимого количества вируса – 103 геномных эквивалентов ВПЧ, приходящихся на 105 клеток, что соответствует литературным данным. Таким образом, в ближайшем будущем арсенал диагностических мероприятий при ВПЧ-инфекции пополнится новой ценной методикой.
Еще один современный метод диагностики ВПЧ находится в стадии разработки и апробации. Специалисты обратили внимание на тот факт, что при наличии выраженных признаков цервикальной неоплазии ДНК ВПЧ методом ПЦР не всегда выявляется в материале из шейки матки при многократных повторных исследованиях. В то же время активизируется синтез продуктов вирусных генов Е6 и Е7.
Учитывая особенности патогенеза ВПЧ-инфекции, ученые пришли к выводу, что при интеграции в геном клетки вирус способен утрачивать практически все гены (в том числе и те, которые являются мишенью для ПЦР), за исключением Е6 и Е7, на этом же этапе активизируется синтез белков Е6 и Е7 – продуктов вирусных генов. В норме эти белки в тканях не синтезируются, что дает возможность использовать их в качестве онкомаркеров. Онкобелки будут определяться методом иммуноферментного анализа непосредственно в цервикальном материале, то есть в органе-мишени. Измерение уровня этих белков даст возможность определить стадии ВПЧ-инфекции (повышенный синтез указывает на интегративную фазу, когда вероятность спонтанной регрессии крайне мала), агрессивность зарождающегося процесса (коррелирует с уровнем Е7), резистентность ВПЧ-ассоциированных заболеваний к терапии интерфероном (коррелирует с уровнем Е7).
В приказе МЗ Украины от 31 декабря 2004 г. № 676 «Про затвердження клінічних протоколів з акушерської та гінекологічної допомоги» вирусологические методы исследования при фоновых и предраковых заболеваниях шейки матки рекомендованы как дополнительные при наличии показаний, а молекулярно-биологические методы не оговариваются вообще. Тем не менее для профилактики распространения ВПЧ, предупреждения развития предрака и рака, снижения заболеваемости и смертности от РШМ необходимо повысить качество диагностики папилломавирусной инфекции, используя все доступные современные методы лабораторной диагностики, предоставленные в распоряжение врачей-клиницистов.
Подготовила Александра Яковец