27 березня, 2015
Автоматизированный анализ крови: методологические нюансы
Общий анализ крови (ОАК) предоставляет клиницистам важнейшую информацию, так как характеризует физиологическое состояние организма, изменяющееся под воздействием различных внешних и внутренних факторов, и является неотъемлемой частью диагностического процесса и последующего мониторинга на фоне проводимой терапии.
С тех пор, как в 1895 году швейцарский врач Сали впервые предложил колориметрический метод определения концентрации гемоглобина в крови, прошло более 100 лет, однако до сих пор общий анализ крови не потерял значимости и актуальности. Развитие прикладных медицинских наук усовершенствовало подход к этому исследованию, но не изменило его сути. По-прежнему врачей интересует концентрация гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в единице объема крови, скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и лейкоцитарная формула. Однако на смену рутинному подсчету клеток в счетной камере и визуальному определению гемоглобина в гемометре Сали пришли новые технологии, реализованные в гематологических анализаторах. Помимо общеизвестных показателей, использование анализаторов позволило пополнить ОАК новыми диагностически значимыми параметрами, которые расширили понимание процессов, происходящих в крови в норме и при той или иной патологии.
Целью данной статьи не является реклама преимуществ автоматизированного анализа крови перед рутинным или описание клинического значения современного ОАК (его практикующие врачи и без того отлично понимают); основная задача – обратить внимание врачей-клиницистов на некоторые нюансы современного варианта этого исследования и обеспечить информацией, позволяющей адекватно оценить не только состояние пациента, но и достоверность тех данных, на основании которых врач будет разрабатывать лечебную тактику.
Принцип подсчета клеток крови в гематологических анализаторах
В современных гематологических анализаторах технология подсчета форменных элементов крови основана на кондуктометрическом методе, предложенном H. Wallace и Joseph R. Culter в 1947 г. Принцип метода заключается в подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клетки через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Каждое прохождение клетки через апертуру сопровождается появлением электрического импульса, который регистрируется электронным датчиком. Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать количество импульсов, которые при этом генерируются. Если в один и тот же момент в канале находятся 2 клетки, то они регистрируются в виде одного импульса, что приводит к ошибке в подсчете клеток. Во избежание этого производится разведение пробы изотоническим раствором до такой концентрации, чтобы в единицу времени в канале датчика находилась только одна клетка. Однако при плохом перемешивании (гомогенизации) образца крови перед исследованием возможно возникновение такой ошибки даже при правильном подборе разведения.
Разделение клеток по категориям (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, осадок) осуществляется прибором на основании анализа амплитуды полученных импульсов. Небольшие по размерам клетки (тромбоциты) генерируют импульсы низкой амплитуды, а сравнительно большие клетки (лейкоциты, эритроциты) – импульсы высокой амплитуды. Устройство, называемое «дискриминатор», разделяет амплитуды импульсов по величине, что и дает возможность отдельно подсчитать количество тромбоцитов и эритроцитов. Поскольку размеры лейкоцитов близки к размерам эритроцитов и их не удается выделить указанным методом, они неизбежно будут влиять на подсчет эритроцитов. Однако за исключением явных лейкоцитозов (> 50х109/л), это влияние будет незначительным, так как в норме концентрация эритроцитов в крови на 3 порядка превышает концентрацию лейкоцитов. В то же время при подсчете количества лейкоцитов необходимость разрушения эритроцитов очевидна. Эта задача легко разрешима, так как свойства мембран лейкоцитов и эритроцитов существенно различаются, и эритроциты легко лизируются под воздействием многих поверхностно-активных веществ (ПАВ).
Под воздействием тех же ПАВ различные формы лейкоцитов претерпевают сжатие (изменение размеров) разной степени, что и лежит в основе их разделения кондуктометрическим методом на три основные популяции: гранулоциты, лимфоциты и так называемые средние клетки (рис. 1). В область малых объемов (35-90 фл) попадают лимфоциты, которые значительно уменьшаются в размере. Гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы), напротив, подвергаются небольшому сжатию и расположены в области больших объемов (120-400 фл). Между двумя пиками имеется зона средних клеток, которая лучше всего соотносится с моноцитами (по этой причине в некоторых анализаторах эти клетки указываются как моноциты). Однако при измерении клеток кондуктометрическим методом в зону средних клеток могут попадать также базофилы и эозинофилы, особенно если они частично или полностью дегранулированы, поэтому более корректным названием параметра следует считать «средние» клетки (MID), а не моноциты, и учитывать этот факт при работе с результатами ОАК, полученными на анализаторе с тремя дифференцировочными зонами для лейкоцитов без морфологического изучения формулы крови.
Таким образом, кондуктометрический метод позволяет определять большинство эритроцитарных и тромбоцитарных показателей, связанных с объемом клеток, а также является основой для трехчленной дифференцировки лейкоцитов. В анализаторах последнего поколения вышеописанный метод объединен с использованием различных дифференцировочных лизатов, лазерного светорассеивания, радиочастотного анализа, иммуноцитохимического метода, что значительно расширяет возможности исследования и позволяет определять до 30 параметров крови, включая полный анализ лейкоцитарной формулы и подсчет ретикулоцитов.
Результаты автоматического гематологического анализа представлены в виде цифровых значений (абсолютных или относительных), а также графически – в виде гистограммы распределения клеток по объему. Гистограммы, предоставляющие дополнительную информацию, рекомендуется рассматривать параллельно с цифровыми значениями, они обязательно должны присутствовать на бланке исследования.
Материал для проведения общего клинического анализа крови
Венозная кровь считается оптимальным материалом для клинического исследования. Это обусловлено тем, что при известной стандартизации процессов забора, хранения, транспортировки крови удается добиться минимальной травматизации и активации клеток, примеси других веществ (тканевой жидкости), при этом всегда имеется возможность повторить и/или расширить анализ.
Пункция кожи с целью получения капиллярной крови является процедурой выбора в тех ситуациях, когда получение венозной крови невозможно (у новорожденных, ожоговых больных, при выраженном ожирении, спавшихся венах). Однако следует помнить, что при прохождении капиллярной крови через поврежденную ткань активируются процессы свертывания крови, а с тканевой жидкостью в образец попадает большое количество тромбопластина, что влечет за собой образование в пробирке микросгустков.
Что касается нормальных значений основных показателей крови, то в литературе нет указаний на какие-либо достоверные различия в клеточном составе венозной и капиллярной крови, а также в концентрации гемоглобина и СОЭ.
Основные показатели гематологических анализаторов и факторы, влияющие на их значение
WBC (white blood cells) – количество лейкоцитов крови (х109/л). Ошибки в подсчете числа лейкоцитов на автоматическом анализаторе возможны в сторону его повышения при наличии в крови нормобластов или устойчивых к лизису эритроцитов, агрегатов тромбоцитов, криоглобулинов или криофибриногена.
В таких случаях в большинстве современных анализаторов появляются сообщения об ошибке («флаги»), распечатываемые на бланке анализа. Ложное занижение показателя возможно при длительном хранении крови (более 24 ч) или грубом перемешивании.
RBC (red blood cells) – количество эритроцитов крови (х1012/л). Ложнозавышенные результаты наблюдаются при наличии в крови гигантских тромбоцитов, криоглобулинов. Ложное занижение результатов может быть следствием агглютинации эритроцитов (в том числе холодовой), повышения вязкости крови при ее охлаждении во время хранения или транспортировки, наличия микросгустков из-за плохого перемешивания с антикоагулянтом сразу после забора крови, выраженного микроцитоза эритроцитов. При параллельном подсчете эритроцитов в камере Горяева расхождение результатов может достигать 30% вследствие частичного гемолиза и неточного дозирования при разведении эритроцитов вручную, поэтому «перепроверять» количество эритроцитов рутинным методом нецелесообразно.
HGB (hemoglobin) – концентрация гемоглобина крови (в г/л или г/дл). Концентрация гемоглобина в большинстве гематологических анализаторов определяется спектрофотометрически гемоглобинцианидным или другими методами. На результат может повлиять гиперлейкоцитоз (>50х109/л), а также повышенное содержание в крови нейтральных жиров (липемия), что связано с техническими возможностями прибора, а не с методологией измерения. Избежать влияния липемии можно при правильной подготовке пациента к анализу (диета накануне исследования, сдача крови натощак). Контролем за правильностью измерения гемоглобина может служить показатель МСНС.
MCV (mean corpuscular volume) – средний объем эритроцитов. В моделях современных гематологических счетчиков осуществляется автоматическое измерение объема каждого эритроцита; таким образом, значение MCV в этих приборах представляет собой среднюю величину объема всех измеренных эритроцитов. Показатель MCV имеет диагностическое значение при оценке микро-, нормо- и макроцитоза, также его используют в расчетах среднего содержания и концентрации гемоглобина в эритроцитах. В норме средний объем эритроцита составляет от 80 до 100 фл. Эти значения MCV характерны для нормоцитов. Если величина MCV меньше 80 фл, говорят о микроцитозе, если больше 100 фл – о макроцитозе. Ложное завышение MCV может происходить в случае присутствия холодовых агглютиатов (они воспринимаются прибором как одна большая клетка), при гипергликемии и диабетическом кетоацидозе вследствие гиперосмолярности плазмы (из-за чего при разведении in vitro происходит быстрое набухание эритроцитов). Относительное снижение MCV может наблюдаться при повышенном содержании фрагментов эритроцитов вследствие механического гемолиза, коагулопатии потребления, присутствия гигантских тромбоцитов. Необходимо учитывать, что MCV может иметь нормальное значение при наличии у пациента одновременно выраженного макро- и микроцитоза, поэтому MCV всегда следует рассматривать в совокупности с эритроцитарной гистограммой (рис. 2) и показателем RDW.
У каждого конкретного пациента при отсутствии патологии со стороны кроветворения MCV является довольно стабильным показателем и при исследовании в динамике на одном и том же анализаторе может служить индикатором работы прибора.
RDW (red cell distribution width) рассчитывается как коэффициент вариации среднего объема эритроцитов по формуле: RDW = (SDх100%)/MCV, где SD – стандартное отклонение объема эритроцитов от среднего значения. В норме показатель RDW не превышает 11,5-14,5%, а в некоторых анализаторах, использующих несколько иной статистический подход, – 12,0%. При высоком значении RDW (высокая степень гетерогенности эритроцитов) MCV становится малоинформативным в силу своей усредненности. С другой стороны, при наличии в крови клеток с измененным, но однородным объемом (например, микроцитов), значение RDW может быть в пределах нормы, так как оно характеризует колебания объема клеток внутри популяции и не связано с абсолютной величиной объема эритроцита. Графически увеличение RDW отображается уплощением и растягиванием эритроцитарной гистограммы.
HCT (hematocrit) – гематокрит – в гематологических анализаторах представлен суммой объемов эритроцитов в единице объема крови, поэтому проблемы «остаточной плазмы» при таком измерении не существует. Ошибки определения гематокрита аналогичны таковым при измерении MCV.
MCH (mean corpuscular hemoglobin) – среднее содержание гемоглобина в эритроцитах. Этот показатель характеризует среднее содержание гемоглобина в одном эритроците в абсолютных единицах массы – пикограммах (1 пг = 1х10-12г). Его определяют путем деления концентрации гемоглобина в 1 л на число эритроцитов в том же объеме: MCH = HGB/RBC. MCH аналогичен цветовому показателю (ЦП), к которому и сейчас традиционно прибегают многие специалисты. Цветовой показатель, как известно, – величина относительная и, по современным данным, является отношением количества гемоглобина в одном эритроците пациента к нормальному его содержанию (принятому равным 33,3). Таким образом, чтобы перейти от значения MCH к более привычному ЦП, достаточно разделить MCH на 33,3.
Нормальные значения MCH лежат в диапазоне 26-34 пг. Необходимо помнить, что снижение или повышение MCH не всегда свидетельствует о гипо- или гиперхромии эритроцитов. Например, при микроцитарной анемии среднее содержание гемоглобина в эритроцитах будет снижено вследствие уменьшения объема эритроцитов, в то время как их нормохромная окраска будет сохранена. В связи с этим показатель MCH сравнительно редко используется в клинической практике для характеристики анемий.
МСНС (mean corpuscular hemoglobin concentration) – средняя концентрация гемоглобина в эритроците. Вычисляется по формуле: MCHC = HGB (г/дл)/HCT (%)
х 100 (г/дл). Различия между MCH и МСНС заключаются в том, что MCH указывает на массу гемоглобина в одном эритроците и выражается в долях грамма (пг), тогда как МСНС показывает концентрацию гемоглобина в одном эритроците, то есть соотношение содержания гемоглобина к объему клетки. Он напрямую связан с синтезом гемоглобина и отражает насыщение эритроцита гемоглобином.
В норме МСНС составляет 30-38 г/дл. В отличие от MCH МСНС не зависит от клеточного объема и является чувствительным показателем нарушений гемоглобинообразования. При развитии заболеваний, сопровождающихся нарушением синтеза гемоглобина, МСНС снижается в последнюю очередь, когда истощаются компенсаторные реакции организма, поэтому пониженное значение этого параметра на фоне нормального содержания эритроцитов и гемоглобина может свидетельствовать о некорректно проведенном исследовании.
Предельная концентрация гемоглобина в эритроците (38 г/дл) тоже встречается довольно редко. Это связано со строением молекулы гемоглобина, растворимостью ее в воде и, соответственно, способом упаковки в эритроците.
При работе с гематологическим анализатором оператор (лаборант) занимает достаточно активную позицию и может кардинальным образом влиять на корректность получаемых данных, имея свободный доступ к калибровочным механизмам прибора и непосредственной подготовке образца крови к измерению. При неумелом проведении достоверность автоматизированного анализа крови заметно снижается. Однако знание принципа работы гематологического анализатора, причин возможных погрешностей в измерении, внимательное изучение всех клеточных параметров, выдаваемых анализатором, в совокупности с гистограммами, реагирование на сообщения об ошибке («флаги») даст врачу наиболее полную информацию как о качестве проведенного исследования, так и о состоянии пациента.
Подготовила Александра Яковец