27 березня, 2015

Про перспективи використання нанотехнологій в експериментальній та клінічній онкології

Резистентність пухлин до протипухлинних препаратів та неспецифічність дії лікарських препаратів при їх системному введенні – важливі проблеми сучасної онкології. Адже при введенні протипухлинного препарату в кров він діє не лише на вражені тканини, а й на здорові, які активно проліферують, зокрема клітини імунної системи. У результаті лікування дає тяжкі наслідки для організму: дисбактеріоз, імуносупресія, лейкопенія та інші (Птушкін, 2004). Розв’язання цього питання дозволило б контролювати та збільшувати ефективність лікування (Дудниченко, 2000).

В.Ф. Чехун Відомо, що внутрішньовенно не слід вводити розчини препаратів, що містять великі частинки, адже це може призвести до емболії. Безпечно можна вводити в кров частки розмірами не більше одного мікрометра. Таким чином, розв’язувати проблему неспецифічності ліків необхідно лише в цих нанодіапазонах (Мисюров, 2005).
Ще в п’ятдесятих роках минулого століття у світі, у тому числі й у нашій країні, досліджували ліки, введені в ліпосоми. Проте вони були недостатньо очищені й ефективність їх була невисокою. З іншого боку, фізиками було запропоновано можливість створення та використання частинок розмірами порядку нанометрів, які легко піддаються модифікаціям, для вирішення багатьох проблем і зокрема в медицині. Дані літератури свідчать, що в сучасній медицині проводиться дослідження з використання ліків, створених на основі нанотехнологій. Розвиток техніки відкрив можливість використання наночастинок для доставки ліків безпосередньо в клітину (Shoaib, 2007). Так, було розроблено систему доставки наночастинок лікарських препаратів з використанням магнітного поля для їх направлення в клітини пухлини. Проте ще залишається малодослідженим питання механізму дії таких ліків на клітину (Дудниченко, 2000).
Наночастинки довгий час циркулюють, не втрачаючи ефективності (Vasir, 2005). Також їх можна покрити ліпідною оболонкою та ввести агент для направлення в певну пухлину; такі системи можуть бути стабільними до дії кишково-шлункових ферментів, тому їх можна використовувати не лише для внутрішньовенного введення, а й для лікування пухлин кишечнику (Orive, 2003; Kayser, 2005).
Невеликі розміри часток та їх специфічність – головні напрями в онкофармакології. Наносистеми спрямованого транспорту відкривають для неї великі перспективи (Мисюров, 2005).

Наносистеми спрямованого транспорту
На сучасному етапі розвитку нанонаук виділяють такі системи спрямованого транспорту (Levy, 2002):
1. Ліпосоми
2. Міцели
· Фосфоліпідні міцели:
– міцели на вуглеводній основі;
– полі-L-амінокислотні міцели;
– міцели на основі полістиролу.
3. Наноемульсії
· Cистеми наночастинок:
– солідні наночастинки;
– наночастинки на основі ліпідів;
– наночастинки на основі полімерів;
– наночастинки на основі кераміки;
– нанокристали;
– альбумінові наночастинки;
– наногелі;
– магнетонаночастинки;
– дендримерні нанокомпозити.
Найперспективніші серед систем спрямованого транспорту нанокомпозити, оскільки вони можуть довго зберігатися, їхня структура дозволяє приєднувати різні протипухлинні препарати, не знижуючи їх ефективності, а керування процесом можна здійснювати ззовні (Levy, 2002).

Нанокомпозити
Розрізняють такі типи нанокомпозитів (Mason, 2002):
Тип 1. Органічний компонент, вставлений в неорганічну матрицю без ковалентних зв’язків між ними.
Тип 2. Органічний компонент, вставлений в неорганічну матрицю з сайтами ковалентних зв’язків між ними.
Тип. 3. Взаємоз’єднана сітка неорганічного й органічного полімеру без ковалентних зв’язків між ними.
Тип 4. Взаємоз’єднана сітка неорганічного й органічного полімеру з ковалентними зв’язками між ними.
Тип 5. Безусадочна одночасна полімеризація неорганічних та органічних полімерів.
Широкий спектр їх виготовлення дає можливість підібрати композит з необхідними властивостями. А відсутність ковалентних зв’язків між елементами дозволяє ввести у матрицю протипухлинний препарат, який буде поступово вивільнюватися.
У біології та медицині використовуються нанокомпозити на основі срібла для санітарно-гігієнічних засобів, глюконату кальцію – для створення протезів, вуглецю – в стоматології (Vaudreuil, 2007; Gao, 2005).
Найбільш досліджуваними у медицині є нанокомпозити на основі феромагнетиків, показана їх низька токсичність у клітинах та можливість доставити їх у визначене місце з використанням магніту (Романовский, 2004).
Феромагнетики – це особливий клас магнетиків, їм притаманна намагніченість за відсутності зовнішнього магнітного поля.
Навколо нерухомих електричних зарядів існує тільки електричне поле. Електричні заряди, що рухаються, і змінне електричне поле створюють у навколишньому просторі магнітне поле. Через нього здійснюються взаємодії електричних струмів, постійних магнітів і струмів з магнітами. Електричні взаємодії струмів малі порівняно з їхніми магнітними взаємодіями.
У сучасній фізиці магнітне поле характеризують векторною величиною – магнітною індукцією B. Прийнято вважати, що вектор B у будь-якій точці А магнітного поля збігається за напрямком із силою, що діє на північний полюс нескінченно малої магнітної стрілки, поміщеної в точці А: на полюси цієї стрілки діє пара сил, що встановлює її в напрямку до вектора B.
Структура наноферомагнетиків така: колоїдні дисперсні магнітні матеріали – часточки (Fe₃O₄ або γ-Fe₂O₃) розмірами від 5 нанометрів до 10 мікрометрів стабілізуються в полярному (водному або спиртовому) та неполярному (вуглеводному і силіконовому) середовищах за допомогою поверхнево-активних молекул та полімерів. Їм притаманна текучість, магнітні властивості та стійкість протягом двох-п’яти років (Романовский, 2004).
Кон’югація нанокомпозиту на основі феромагнетику з лікувальним препаратом без ковалентних зв’язків дозволяє транспортування і вивільнення ліків у призначеному місці. Для цього можуть бути використані магнітні властивості частинок, які рухаються по кровоносному руслу за допомогою магнітного поля у напрямку пухлини, керовані спеціальним зовнішнім магнітом. Більше того, можна розраховувати на якоюсь мірою контрольоване утримання кон’югату у хворому органі. Поступова десорбція протипухлинної речовини з полімерної матриці, до якої вона приєднана, може призвести до пролонгації її дії (Goldberg, 2007).
Феромагнітну речовину вкривають оболонкою, яка ізолює її від зовнішнього середовища з утворенням на ній деяких функціональних груп (-СООН, -NH₂, епокси- й ін.). Оболонка може синтезуватися з різних матеріалів, наприклад полістиролу, поліакриламіду, оксиду кремнію, полімерів амінокислот, декстрану, целюлози та ін., залежно від призначення та умов використання. До такої поверхні можуть бути ковалентно приєднані сенсорні молекули: антитіла, їх фрагменти, молекули клітинної адгезії, а також інші розпізнавальні молекули. Проте обмеження використання цих молекул полягає у зменшенні активних ділянок зв’язування при довільній просторовій орієнтації. Тому необхідно використовувати або молекули з достатньою кількістю сайтів зв’язування, або створювати комплекси молекул, щоб відкрити активні ділянки (Schwertmann, 1991).
Встановлено, що in vivo наночастинки з ліками, вкриті доцетакселем та олігонуклеотидними аптамерами у конформації невеликих розмірів, не імуногенні та з тривалим часом циркуляції, поряд з низькою токсичністю здатні зменшити розмір пухлини передміхурової залози (Farokhzad, 2006).
Покриття наночастинок поліетиленоксидом модифікує поверхню, надаючи їм гідрофільних властивостей, що знижує їх атаку макрофагами. Частинки рН-чутливі та вивільняють ліки за певних значень рН, притаманних пухлинним клітинам. Такі частинки здатні зменшувати об’єм пухлин, при цьому знижується шанс розвитку множинної лікарської резистентності (Devalapally, 2007).
Одним з прикладів оболонки є ліпідна мембрана. Оскільки існують такі системи, то варто розглянути окремо ліпосоми. Ліпосоми отримують діючи ультразвуком на водний розчин фосфоліпідів . Таким чином, формується двошарова ліпідна структура, що має внутрішню порожнину, заповнену водою, яку можна замінити лікарським препаратом. На поверхню мембрани можна ввести вектор, який буде направляти систему.
У ліпосоми можна включати різні речовини, причому низькомолекулярні водорозчинні препарати містяться переважно у внутрішній водній фазі, а високомолекулярні ліпофільні – сорбуються на їх зовнішній поверхні за рахунок створення водневих зв’язків з полярними групами ліпідів, що забезпечує трифакторне надходження препарату в тканини. Встановлено, що навіть уведення інтактних (без препарату) ліпосом значно підвищує ефективність препарату, оскільки він може адсорбуватися на їх поверхні. Речовина, яка знаходиться в середині ліпосоми, захищена від дії ферментів, що збільшує ефективність препаратів. Ще одна їх перевага – це поступове виведення препарату і, як наслідок, збільшення терміну дії (Матвієнко, 2004).
Показано, що приєднання до мембрани ліпосом Tat-білка призводить до присутності таких ліпосом у внутрішньоклітинному просторі клітин карциноми Льюїса – людській пухлині молочної залози (Torchilin, 2001).
Також використовуються рН-чутливі ліпосоми, дія яких заснована на чутливості до рН від 6 до 7,4; у такому випадку вивільнення препарату відбувається за певних фізіологічних умов, тобто в організмі, якщо ліпосома чутлива до фізіологічних рН; або в пухлинах, де рН нижче фізіологічних (Morishita, 1997).
Таким чином, магнітоліпосоми – це системи, сконструйовані на основі магнітних наночастинок, обгорнутих ліпосомальною оболонкою. У літературі відмічається, що вони мають виражений протипухлинний ефект іn vіtro й іn vіvo у тварин. Однак їхня дія на клітини імунної системи практично не досліджена. Завдяки ліпосомальній оболонці в неактивованому стані магнітоліпосоми нетоксичні й можуть бути доставлені в необхідну точку за допомогою магнітного поля, до якого злоякісні клітини більш чутливі, ніж нормальні, і де вивільняється лікарський препарат, укладений у ліпосомальну оболонку. Це допомагає зменшити токсичну дію застосовуваного препарату на нормальні тканини. Іншою можливістю підвищити тропність магнітоліпосом до пухлинних клітин є кон’югація зі специфічними антигенами, що експресуються на поверхні пухлинних клітин, імуноглобулінів з біотином та абсорбція кон’югата на поверхні металевого ядра магнітоліпосоми, покритій стрептовідином. Такий підхід успішно апробований при лікуванні колоректального рака, у тому числі й метастазуючого (Zhang, 2005; Fortina, 2007).
З іншого боку, є дані про існування так званих ліпоплексів, коли ліпіди формують комплекси з негативно зарядженою «голою» ДНК. Така ДНК не викликає імунної реакції в організмі, а ліпосоми здатні транспортувати певну сполуку всередині (LIU, 2004).
Однією з систем доставки ліків може бути так звана наноклітина, яка складається з ядра наночастинки та над’ядерного комплексу (пегільований ліпідний конверт). Система складається з двох типів ліків. Перші – зовнішні антиангіогенні агенти – вивільняються в кров’яному руслі, викликаючи зменшення просвіту судин, а другі – протипухлинні препарати – зберігаються в середині (Sengupta, 2005).

Фармакокінетика
Існують різноманітні шляхи введення препарату в організм, що зумовлено їх дією (місцевого призначення та системні), а також тривалістю надходження (швидкі – безпосередньо в кров’яне русло; повільнодіючі – через шлунково-кишковий тракт). В онкології найчастіше використовують внутрішньовенне введення препарату (Овчинникова, 2007).
Дані літератури свідчать, що при надходженні нанокомпозитів у кров’яне русло вони піддаються атаці лейкоцитів (Frampton, 2006). При взаємодії з еритроцитами наноферомагнітні частинки заліза накопичуються в них. На еритроцитах мишей було показано, що цей процес залежить від концентрації та радіуса наночастинки (Soler, 2007).
При введенні наноферомагнетиків у мозок для лікування злоякісних пухлин встановлено, що залізо виявляється в реактивних клітинах, тобто астроцитах та макрофагах, а не в пухлинних клітинах. При цьому дослідники вважають, що виявлення заліза в таких випадках може використовуватися для післяопераційної візуалізації (Neuwelt, 2004).
У печінці наночастинки поглинаються клітинами ретикулоендотеліальної системи, у відповідь на що розвивається запалення, яке стимульоване утворенням вільнорадикальними формами кисню й сигналами через кальцієві канали. Подібна запальна реакція відзначається й у головному мозку. Крім того, препарати на основі наноферомагнетиків здатні накопичуватися в селезінці та печінці в макрофагах, де вони метаболізуються (Okon, 1994).
При внутрішньовенному введенні мишам покритих декстраном суперпарамагнітних наночасток оксиду заліза, вони швидко захоплюються клітинами мононуклеарної фагоцитарної системи (Borm, 2006; Elder, 2006).
Описано фармакокінетичну криву розподілу наночастинок заліза в печінці. Внутрішньовенне введення нанокомпозиту приводить до нагромадження його в печінці в перші години, досягаючи максимуму, а потім поступово знижується протягом 3 діб. Проте через деякий час знову фіксується зростання його концентрації в печінці (Weissleder, 1989; Okon, 1994; Lacava, 2001). При цьому відзначається, що для виведення наночастинок оксиду заліза з печінки більш важливе їхнє покриття, ніж розмір (Briley-Saebo, 2006). Гістохімічні дослідження показали, що наночастинки заліза у вигляді гранул накопичуються в купферівських клітинах печінки (Okon, 1994; Van Beers, 2001).
Розподіл наночастинок у селезінці дещо відрізняється від розподілу в печінці. При введенні внутрішньовенно композиту в селезінці спостерігається поступове його накопичення протягом 48 годин, а потім рівень поступово знижується. За даними гістохімічних досліджень, наночастинки заліза у вигляді гранул накопичуються в макрофагах маргінальної зони селезінки, у лізосомах купферівських клітин і макрофагах червоної пульпи селезінки (Weissleder, 1989; Pouliquen, 1991; Okon, 1994).
Доцільно окремо розглянути фармакокінетику ліків, зв’язаних з феромагнетиками. Оскільки препарат адсорбований на поверхні носія, а не з самим феромагнетиком, то це дозволяє впливати на динаміку його вивільнення у пухлині під впливом зовнішнього магнітного поля, оскільки феромагнетик, що зберігає свої властивості, може утримувати ще зв’язаний препарат у певному місці. Необхідно зазначити, що при застосуванні низьких доз кон’югатів побічних ефектів практично не спостерігається (Scott, 2001).
Перспективною для досліджень є ліпосомальна форма наноферомагнетиків. Було показано, що нагрівання цієї форми змінним зовнішнім магнітним полем (частотою 3,5 МГц за три прийоми) до 44°С приводить до масивного вивільнення препарату у місці доставки (направленість до пухлини забезпечується ліпосомою). Використання цього ефекту приводить до значного цитотоксичного ефекту в пухлині іn vіvo. Внутрішньовенне введення ліпоферомагнетиків, зв’язаних з доксорубіцином, під впливом зовнішнього магнітного поля створює в остеосаркомі концентрацію доксорубіцину в 4 рази вищу порівняно зі звичайним шляхом введення цього цитостатика. Одночасно побічні ефекти застосування доксорубіцину значно знижуються (Kubo, 2001; Babincovа, 2004).
Показано підвищення вивільнення цитостатика в пухлині з магнітоліпосом, які містять цисплатин, при застосуванні зовнішнього магнітного поля. Крім того, використання ротаційного магнітного поля створило можливість контролювати термін вивільнення препарату з комплексу (Jordan, 1997).
Таким чином, захоплення феромагнетиків після внутрішньовенного введення відбувається переважно двома системами: кров’яними тільцями, де залізо необхідне як джерело для формування гему, та клітинами, які можуть виступати в ролі депо заліза для організму. До того ж частина препарату може нейтралізуватися імунною системою. Отже, необхідно створити системи нанокомпозитів, які б були «своїми» для організму.

Взаємодія з клітиною
Надходження нанокомпозиту в нормальну клітину досліджувалося, але про надходження в пухлинну клітину даних мало. Було встановлено, що надходження наночастинок заліза в макрофаги залежить від розміру частинок і сполук, що використовувалися для їх контрастування. Так, наночастинки заліза, покриті декстрином, надходять у клітину за допомогою ендоцитозу, а додатково опсонізовані альбуміном – за допомогою рецептор-опосередкованого ендоцитозу. Як відомо, будь-які часточки захоплюються клітиною шляхом ендоцитозу і потрапляють в її лізосомальний апарат (рис. 1 ; Raynal, 2004).
Імуногістохімічне дослідження дозволило встановити, що наночастинки заліза, покриті декстрином, після контакту з клітиною надходять у лізосомальний апарат, а через три доби локалізуються в перинуклеарних везикулах, які, швидше за все, являють собою термінальні везикули (Schulze, 1995).
Вважається, що ліпоплекси в клітині захоплюються шляхом ендоцитозу та вивільняються в первинних лізосомах (LIU, 2004).
Ще не відомий точний метаболізм феромагнетиків як у нормальній, так і зміненій клітинах. Проте можна припустити, що він подібний до метаболізму звичайного заліза у клітинах печінки та селезінки (рис. 2 ).
Надлишок заліза й акумуляція його в різних органах здатні викликати фіброз печінки, міопатію, серцеву недостатність. За нормальних умов залізо потрапляє до клітин зв’язаним з трансферином. При цьому у клітині залізо у зв’язаному стані здатне нейтралізувати вільні радикали кисню (Britigan, 1994). Надходження у клітину заліза, зв’язаного з трансферином, рН-залежне, рецептор-опосередковане, контролюється вмістом заліза. Відбувається це шляхом ендоцитозу в складі ендосом, де за рахунок зниження рН до 5,4 відбувається від’єднання заліза і надходження його в цитоплазму. Трансферин виводиться назовні клітини. Внутрішньоклітинний вільний пул заліза регулює проліферацію клітини, синтез гемових білків, експресію рецепторів до трансферину. Частина заліза, яка не використовується клітиною, зберігається у вигляді феритину (Єрмоленко, 2004).
Феритин формує стабільні олігомери, надлишок яких відкладається у вигляді аморфних кристалів у лізосомах клітин печінки та селезінки. Субодиниці апоферитину складаються з легких (збереження запасів заліза) та тяжких (детоксикація іонізованого заліза, а також його транспорт). У різних органах їх співвідношення різне, що визначає їх мікрогетерогенність.
Феритин синтезується багатьма клітинами, проте переважно клітинами печінки та селезінки, які є депо заліза в організмі.
Надходження заліза в клітину ентероцита відбувається за допомогою білків, що зв’язують залізо в кишечнику: мобілферин і β₃-інтегрин (засвоєння Fe³⁺) та двовалентний транспортер металів (divalent metal transporter, DMT-1) (засвоєння Fe²⁺) (Андреєв, 2003).
Доцільно розглянути механізм взаємодії ліпосом з клітиною, оскільки є перспективним їх використання у комплексі з наноферомагнетиками як системи доставки ліків. Існує не менше двох гіпотез шляхів проникнення ліпосом у клітину. Перша: внаслідок ендоцитозу ліпосома захоплюється клітиною з утворенням вакуолі; фосфоліпази лізосом гідролізують фосфоліпіди мембрани ліпосом, чим забезпечується вихід умісту в цитоплазму клітини. Другий шлях: ліпосома зливається з мембраною клітини, при цьому ліпідний компонент вбудовується в мембрану, а водорозчинний препарат вивільняється в цитоплазму.
Додаткове введення ліпідів (з ліпосоми) у клітину має впливати на їх обмін. Так збільшується внутрішньоклітинний пул жирних кислот, що вивільняються внаслідок розчеплення оболонок, а склад самих ліпідів у мембрані ліпосом визначає їх подальше використання самою клітиною (Кобринський, 1988).
На ізольованих ядрах були проведені досліди про вплив заряду фосфоліпідів ліпосом на транскрипцію. Установлено, що негативно заряджені фосфоліпіди ліпосом призводять до зростання, а нейтральні, навпаки, – до зменшення транскрипційної активності, що свідчить про наявність певних взаємодій між ядром та фосфоліпідами (Boicelli, 1988).

Висновки
В активній доставці лікарських препаратів використовується здатність пухлин експресувати антигени або рецептори, які можна використовувати як мішені. У такому випадку ліганди, які специфічно зв’язуються з рецепторами або детермінантами, ковалентно або нековалентно приєднуються до наночастинки. Наприклад, кон’югація наноструктур зі специфічними антитілами забезпечує прикріплення наноструктур до певних клітин, що містять відповідні рецептори або антигени, й створює підвищене накопичення їх біля вогнища. Кон’югація наноструктур з лікарськими препаратами дозволить створити підвищену концентрацію препарату у вогнищі, запобігаючи токсичному впливу препарату на нормальні клітини (Altin, 2006; Zeng, 2007).
Не виключено, що використання магнітоліпосом також призведе до зростання специфічності дії препарату (Zhang, 2005; Fortina, 2007), оскільки можна регулювати ліпідний склад ліпосом та поверхневі маркери. З іншого боку, зв’язок нанокомпозиту з певною міткою дозволить направляти ліки в середину клітини.
На даний час широко досліджується питання практичного використання наночастинок. Зокрема можливим варіантом є використання наноферомагнетиків для візуалізації пухлин та їх метастазів (Neuwelt, 2004). Для направленої доставки ліків можуть застосовуватися наноклітини, які можуть містити два типи ліків (Sengupta, 2005). Ще однією можливістю їх застосування є використання для лікування пухлин кишково-шлункового тракту, оскільки наночастинки можуть зберігати ліки від дії ферментів (Florence, 2004).
Таким чином, залишається ще багато відкритих питань щодо використання та впливу нанокомпозитів і ліпосом на організм у цілому та пухлини зокрема. Особливо цікавим, на мою думку, є дослідження внутрішньоклітинних аспектів дії систем спрямованого транспорту, зокрема схем проникнення їх в клітину, накопичення і виведення з неї, а також можливий вплив їх компонентів на процеси як в середині окремої клітини, так і пухлини.

Номер: № 20 Жовтень - Медична газета "Здоров’я України"