Два «лица» одной молекулы

Прошло более 20 лет с тех пор, как эндотелий сосудов перестали рассматривать как пассивную внутреннюю выстилку сосудов, обеспечивающую лишь перемещение форменных элементов крови. Сейчас уже ясно, что эндотелий представляет собой своеобразную огромную железу внутренней секреции, состоящую в среднем у человека из 6х10²³ клеток общей площадью до 1000 м² и весом 1,5 кг. Среди соединений, синтезируемых эндотелиоцитами, на первом плане, несомненно, находится оксид азота, удостоенный звания молекулы века, роль которого в регуляции жизненных функций организма человека чрезвычайно велика. Недавно Комитет по государственным премиям в области науки и техники принял к рассмотрению цикл научных работ «Исследование фундаментальных механизмов действия оксида азота на сердечно-сосудистую систему как основы патогенетического лечения ее заболеваний». Наш корреспондент встретился с одним из претендентов на получение Государственной премии, доктором медицинских наук, главным научным сотрудником Института фармакологии и токсикологии АМН Украины, заведующим Межведомственной лабораторией доклинического изучения медицинских средств АМН и МЗ Украины Анатолием Ивановичем Соловьевым и попросил его ответить на ряд вопросов.

— Откуда берется этот газ, оксид азота, в организме человека?

— Синтез оксида азота (NO) в организме человека и животных осуществляется в результате пятиэлектронного окисления концевого атома азота гуанидина аминокислоты L-аргинина с помощью семейства ферментов, определяемых как NO-синтазы и относящихся к классу гемсодержащих циторедуктаз, подобных цитохрому Р-450. Образовавшийся NO представляет собой гидрофобный газ с химическими свойствами, делающими его удивительно подходящим для роли внутри- и межклеточного посредника. Он может существовать в виде относительно стабильного, нейтрально заряженного радикала (NO^·) с липофильными свойствами и резко выраженной тенденцией взаимодействовать, прежде всего, с молекулами, обладающими неспаренным электроном, такими как супероксид анион, железо и молекулярный кислород. NO^· может также подвергаться одноэлектронному восстановлению с образованием нитроксил аниона (NO^–) или, потеряв электрон, превращается в ион нитрозония (NO⁺).

— Какова роль оксида азота в регуляции жизненных функций и как это происходит, по крайней мере, в сердечно-сосудистой системе?

— NO^· представляет собой многофункциональную эффекторную молекулу. Основной его мишенью в клетке (иногда даже говорят о внутриклеточном рецепторе NO^·, что, конечно же, неверно) является растворимая гуанилатциклаза. NO^· связывается с железом каталитической субъединицы фермента, что приводит к росту активности гуанилатциклазы и накоплению внутри клетки циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). Расслабляющий эффект цГМФ-зависимых протеинкиназ на гладкие мышцы реализуется главным образом посредством контроля концентрации Са²⁺ в цитозоле благодаря их влиянию на продукцию инозитол 1,4,5-трифосфата, активности кальциевых АТФаз и активации Са2+-зависимых К⁺ каналов. Есть также данные о том, что NO^· может снижать вход Са²⁺ в гладкомышечные клетки через L-тип кальциевых каналов.

— Насколько универсальна регулирующая роль оксида азота?

— Могу в этой связи привести пример из близкой мне области (моя дочь — нейрофизиолог). Открытие NO принципиально изменило представления о механизмах передачи информации в нервной системе. Классическая картина, когда передача информации между нейронами осуществляется в строго определенных местах (синапсах) и в одном направлении, сменилась концепцией диффузной передачи сигнала. Действительно, NO может распространяться от места его образования во все стороны, в том числе и ретроградно, легко проходя через липидную и водную фазы и взаимодействуя с нервными, глиальными и сосудистыми клетками. С учетом его пороговой концентрации (1 нМ), кинетики, инактивации и времени жизни (»5-20 с), эффективный радиус действия NO^· составляет не менее 300-1000 мкм, что означает вовлечение в сферу его активности миллионов синапсов.

— Что нового открыли отечественные ученые в этой области, каков, в частности, вклад ваших коллег из группы претендентов на Госпремию в общемировую копилку знаний?

— Относительно недавно нами в опытах с использованием интактных и химически сканированных сосудистых гладких мышц и флуоресцентных методов измерения внутриклеточной концентрации Са²⁺ был обнаружен новый, цГМФ-независимый механизм расслабления гладких мышц, обусловленный прямым влиянием NO на сократительные белки гладкомышечных клеток. Было установлено, что NO обладает способностью снижать Са²⁺-чувствительность сократительных белков и этот феномен обусловлен активацией внутриклеточных фосфатаз, ответственных за дефосфорилирование легких цепей миозина. Это открывает перспективы создания принципиально нового класса вазоактивных препаратов, обладающих способностью избирательно модулировать Са²⁺-чувствительность сократительных белков и, тем самым, уровень сосудистого тонуса.

Мои коллеги представили новые данные о том, что система NO играет важную роль в реализации депрессорных и прессорных кардиогенных рефлексов, которые сопровождаются дилатацией и констрикцией периферических сосудов.

Было также установлено, что уровень базального выделения NO определяет эффективность такого фундаментального механизма регуляции функции сердца, как механизм Франка-Старлинга.

Наши коллеги-геронтологи установили существование возрастных особенностей при действии NO в сердечно-сосудистой системе. Показано, что с возрастом уменьшается вазодилататорное влияние эндотелия на тонус сосудов, что создает условия для развития сердечно-сосудистой патологии.

Нам удалось раскрыть один из ключевых механизмов развития артериальной гипертензии, связанный с подавлением эндотелийзависимого компонента расслабления сосудов. В опытах на сосудах крыс с генетически детерминированной гипертензией при одновременном измерении силы сокращения гладких мышц и выделения оксида азота (надо отметить, что это совершенно уникальная методика!) мы показали, что на самом деле выделение оксида азота эндотелиальными клетками не снижается. Уменьшается биодоступность синтезируемого NO для гладкомышечных клеток из-за его быстрой инактивации и перехода в пероксинитрит, а также сопутствующих нарушений условий диффузии NO в сосудистой стенке.

Интересно, что аналогичные изменения в сосудистой стенке имеют место и при воздействии на нее ионизирующей радиации. Стало понятно, почему одним из последствий чернобыльской трагедии стало широкое распространение гипертонической болезни. В опытах на животных нами было показано, что в результате облучения уже к концу первой недели у экспериментальных животных артериальное давление достоверно повышается и удерживается на высоких цифрах до полугода (дальше мы не наблюдали). Связано это, как и в случае развития эссенциальной гипертонии, с нарушением эндотелийзависимой регуляции и метаболизма оксида азота. Об этих исследованиях писали несколько британских журналов и ни одно из отечественных изданий. Впрочем, это и не удивительно. Деньги на исследования тоже были предоставлены британским Thе Wellcome Trust Foundation.

С прикладной точки зрения важно отметить, что нам удалось, используя липосомы (везикулы) из фосфатидилхолина, нормализовать процессы эндотелийзависимой регуляции в сосудах животных с экспериментальной гипертензией как с генетически детерминированной, так и вызванной воздействием ионизирующей радиации. Очередь за человеком. Перспективы открываются просто ошеломляющие.

— Какова роль оксида азота в развитии патологических процессов?

— Параллельно с ростом числа клеточных функций, регулируемых NO, увеличивался и список заболеваний, связанных с нарушением синтеза и/или выделения NO: эссенциальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца и инфаркт миокарда, бронхиальная астма, первичная легочная гипертензия, невротическая депрессия, импотенция, диабет — это далеко не полный перечень патологических процессов, в той или иной степени связанных с изменениями метаболизма NO. Оксиду азота стали приписывать роль основного повреждающего фактора при ишемии мозга, обусловливающего, в частности, нейротоксичность глютамата. Взаимодействие глутамата с NMDA рецепторами и последующий массивный вход ионов кальция является лишь пусковым моментом в цепи событий, приводящих к повреждению нейрона и его гибели при ишемии мозга. Увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ приводит к активации NOS и интенсивному образованию NO и пероксинитрита (ONOO^–), являющемуся непосредственной причиной гибели клеток. Это положение подтверждается тем фактом, что ингибиторы синтазы оксида азота в ряде случаев оказываются весьма эффективными для предотвращения повреждения нейронов при ишемии. В то же время в ряде случаев было показано, что NO может оказывать и отчетливое нейропротекторное действие при ишемии мозга. Есть данные, что такое свойство присуще лишь иону нитрозония (NO⁺).

— Что это за соединение — пероксинитрит, о котором вы упомянули?

— Это очень интересная молекула, о которой, к сожалению, не только практикующие врачи, но и многие фармакологи и физиологи ничего не знают. По сути дела, это как бы второе, недоброе «лицо» оксида азота. Мой друг и коллега, профессор R. Gryglewski из Ягеллонского университета в Кракове, один из отцов — создателей «всемирного эпоса» об оксиде азота, сравнивает переход оксида азота в пероксинитрит с превращением доброго лица доктора Джекилла в злобную физиономию мистера Хайда. Анион ONOO^– не является свободным радикалом, так как неспаренные электроны оксида азота и супероксида соединяются, образуя новую связь.

Превращение лица доктора Джекилла (NO) в физиономию атакующего мистера Хайда (ONOO^–) происходит очень быстро, а последствия такой трансформации часто бывают фатальными для окружающих тканей и организма в целом. Поэтому есть смысл рассмотреть эти превращения более детально. NO^· является самым стабильным из свободных радикалов. Превращение NO^· из физиологического регулятора в токсический агент происходит, как я уже сказал, в результате взаимодействия NO^· c супероксид анионом. После его образования ONOO^- распадается в процессе диффузии от места его образования к органу-мишени на ОН^– и NO₂, буквально сокрушая на своем пути самые различные биомолекулы и биомембраны.

Одним из следствий образования ONOO^- является модификация тирозиновых остатков белковых молекул. Интересно, что один из главных ударов ONOO^- наносит именно по тирозину. Это приводит к деструкции не только многих ферментных и структурных систем, но и к блокированию ряда механизмов клеточной сигнализации, опосредуемой тирозинкиназой, так как образующийся в ходе реакции нитротирозин очень напоминает фосфотирозин, необходимый для этой цели. Что же можно сделать для предотвращения нежелательных последствий, вызываемых действием ONOO^-?

Реальным шансом для сохранения структурной целостности молекулы тирозина в окружении ONOO^- является повышение концентрации SH-содержащих соединений (S-нитрозоглутатиона и/или S-нитрозоцистеина), которые способны образовывать, взаимодействуя с ONOO^-, безопасные S-нитрозотиолы. Это один из возможных путей фармакологической коррекции клеточных повреждений, вызываемых ONOO^-. С этой целью в качестве донора SH-групп, например, может быть использован N-ацетилцистеин.

Приведу несколько примеров из области сердечно-сосудистой патофизиологии и фармакологии, имеющих прямое отношение к нашим исследованиям. Вполне понятно, что размер статьи не позволяет остановиться на детальном анализе роли ONOO^- в развитии всех патологических состояний, изученных нами. Рассмотрим подробнее состояние гипоксии/ишемии и последующей реперфузии. Уже давно стало ясно, что последующая за ишемией миокарда реперфузия не менее, если не более, страшна для тканей, чем сама ишемия. Причина этого заключается в следующем. В условиях дефицита кислорода эндотелиальные клетки накапливают ионы кальция, необходимого для активации синтеза оксида азота. При реперфузии резко увеличивается производство оксида азота и супероксида. Десятикратное увеличение концентрации этих соединений приводит к 100-кратному приросту синтеза ONOO^-. Именно избыток ONOO^- в крови и тканях сосудов и миокарда является причиной появления тяжелых реперфузионных нарушений ритма сердца, включая летальные желудочковые аритмии, а также развитие постишемической сократительной дисфункции миокарда.

В опытах на изолированных папиллярных мышцах крыс, изолированном сердце крыс и наркотизированных животных (крысы и собаки) мы получили убедительные данные, что лабораторно синтезированный ONOO^- (метод синтеза ONOO^- был любезно предоставлен нам коллегами по одному из грантов INTAS из лаборатории химии координационных соединений политехнического института в Тулузе) действительно обладает способностью инициировать аритмии как в изолированных органах, так и в условиях in vivо и in situ.

Детальный анализ механизмов ONOO^--индуцированных аритмий позволил нам прийти к выводу, что аритмогенный эффект оксиданта ONOO^- связан с его повреждающим действием на липидное окружение натриевых и калиевых каналов сарколеммы кардиомиоцитов и нарушением нормального распределения ионов натрия и калия между миоплазмой и внеклеточным пространством. Вероятно, что ONOO^- обладает также способностью прямо влиять на функцию ионных каналов сарколеммы посредством нитрозирования и/или окисления соответствующих канальных белков.

Повреждающий эффект ONOO^- на миокард может быть и опосредованным (связан с его влиянием на коронарное кровообращение), так как хотя он, как и NO, обладает способностью расслаблять гладкие мышцы сосудов, его длительное воздействие на гладкомышечные клетки приводит к тому, что они теряют способность реагировать должным образом на физиологические раздражители, происходит необратимая релаксация гладких мышц.

Один из ключевых вопросов современной кардиологии заключается в том, каким образом можно предотвратить появление сердечных аритмий в постишемическом реперфузионном периоде. С этой целью мы использовали биофлавоноид кверцетин, заключенный в липосомы, приготовленные из фосфатидилхолина (лецитина). Антиоксидантный эффект кверцитина, одного из самых мощных оксидантов, обусловлен его способностью «тушить» свободные радикалы, образующиеся в результате пероксидации. Кроме того, он обладает способностью блокировать липооксигеназу и протеинкиназу С, препятствуя таким образом развитию спазма гладких мышц кровеносных сосудов. Нами показано, что именно протеинкиназа С является ключевым ферментом, ответственным за развитие как локального, так и генерализованного (при гипертензии) вазоспазма.

Липосомальная форма кверцетина показала высокую эффективность в предотвращении реперфузионных аритмий у животных с экспериментальным инфарктом миокарда, а также при моделировании аритмий с помощью ONOO^- в опытах на наркотизированных животных, изолированных препаратах сердечной мышцы и изолированном сердце. Полученные данные свидетельствуют, что протективный и восстанавливающий сократительную функцию сердца эффект липосомальной формы кверцетина связан, прежде всего, с ее способностью нормализовать трансмембранные потоки ионов натрия и калия в миокардиоцитах и в меньшей степени зависит от ее влияния на функционирование митохондрий и продукцию макроэргов. Разумеется, мы отдаем себе отчет, что несмотря на высокую эффективность липосомальной формы кверцетина, продемонстрированную в эксперименте, мы вовсе не думаем, что этот лекарственный препарат станет панацеей при всех видах ишемических и реперфузионных повреждениях миокарда и, тем более, других тканей и органов. Важно то, что эти исследования дадут толчок поиску новых, может быть, более эффективных и универсальных лекарственных средств противооксидантной защиты.

— Расскажите о вашем коллективе, о людях, вместе с которыми вы работали над циклом представленных работ.

— Работа была выдвинута Институтом геронтологии АМН Украины. Среди сотрудников этого Института, прежде всего, хочется упомянуть представленного уже посмертно академика В. В. Фролькиса. Это имя вряд ли нуждается в каких-то комментариях, оно легендарно среди медиков и биологов Украины. Следует сказать и об учениках и сотрудниках В. В. Фролькиса: члене-корреспонденте АМН В. В. Безрукове; академике АМН, члене-корреспонденте НАН и РАМН О. В. Коркушко; докторе медицинских наук О. К. Кульчицком. Институт физиологии им. А. А. Богомольца представляют академик НАН А. А. Мойбенко, член-корреспондент НАН В. Ф. Сагач и доктор медицинских наук М. Н. Ткаченко. И наконец, Институт фармакологии и токсикологии АМН — его директор, академик АМН А. В. Стефанов и ваш покорный слуга. К сожалению, неожиданно, совсем недавно, ушла из жизни Л. Т. Малая, академик НАН и АМН. Вот такой коллектив, хотя и понесший потери, но, тем не менее, еще очень и очень работоспособный.