5 листопада, 2018
Изменение уровня маркеров оксидативного стресса у пациентов с хронической венозной недостаточностью на фоне терапии диосмином
В основе патогенеза многих нарушений в человеческом организме лежит свободнорадикальное окисление и вызванный им оксидативный стресс. Нивелировать последствия этих процессов могут антиоксиданты, к числу которых относится и натуральный флавоноид – диосмин.
Диосмин широко применяется при различных сосудистых патологиях и особенно хорошо зарекомендовал себя у пациентов с хронической венозной недостаточностью (ХВН). Благодаря своей антиоксидантной активности он нейтрализует действие свободных радикалов, а следовательно, снижает уровень биомаркеров оксидативного стресса: простагландинов и их предшественников – изопростанов. Именно изменение их уровня в крови оценивалось у пациентов с ХВН на фоне терапии диосмином.
Качественный анализ проводился с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (HPLC-MS). По результатам исследования было отмечено статистически значимое снижение уровня изопростана через 3 мес лечения в основной группе, однако наиболее впечатляющие результаты удалось получить среди курящих пациентов.
Введение
Диосмин (диосметин 7-O-рутинозид) – натуральный флавоноид, представитель семейства Рутовых (Rutaceae), в большом количестве содержащийся в цитрусовых. Впервые был выделен в 1925 г. из Норичника узловатого (Scrophularia nodosa). Сегодня также может быть получен путем дегидрогенезации другого флавоноида – гесперидина. Широкий спектр биологических свойств диосмина подтвержден в многочисленных исследованиях in vitro и in vivo, где кроме основного антиоксидантного действия он показал антигипергликемический, противовоспалительный, антимутагенный и противоязвенный эффекты.
Выраженное положительное влияние диосмина на сердечно-сосудистую систему делает его сегодня одним из наиболее предпочтительных препаратов в лечении ХВН – прогрессирующего заболевания, частота которого с каждым годом увеличивается. ХВН характеризуется морфологическими и функциональными нарушениями венозной системы, проявляющимися варикозным расширением вен, отеками, структурными изменениями кожных покровов нижних конечностей и образованием трофических язв.
На первой стадии заболевания отмечается устойчивая венозная гипертензия, обусловленная главным образом клапанной недостаточностью. За счет рефлюкса венозной крови увеличивается гидростатическое давление и кровоток в микроциркуляторном русле. Это способствует адгезии лейкоцитов к эндотелию капилляров и инициации воспалительной реакции с повышением проницаемости сосудистой стенки и развитием отека.
В результате ряда клинических исследований было показано, что диосмин снижает выраженность боли и отека у пациентов с ХВН благодаря улучшению лимфатического дренажа и микроциркуляции. Также он повышает резистентность и тонус сосудистой стенки, эластичность вен. Снижает капиллярную фильтрацию и гиперпроницаемость сосудов.
Противовоспалительный эффект диосмина реализуется за счет подавления синтеза провоспалительных цитокинов путем блокирования транскрипционного фактора NF-κB и редукции рецепторов Т-клеток. Вследствие этого проявления ХВН (отек, боль, чувство тяжести и скованности в нижних конечностях) регрессируют, а качество жизни улучшается.
Значительное ослабление симптомов ХВН на фоне приема диосмина может быть также связано и с его антиоксидантной активностью, поскольку свободные радикалы оказывают повреждающее действие на клетку с последующим высвобождением медиаторов воспаления и развитием оксидативного стресса. Последний, в свою очередь, играет очень важную роль в патофизиологии многих нарушений в человеческом организме, а простагландины и их изомеры – изопростаны рассматриваются как биомаркеры оксидативного стресса. Так, например, повышенный уровень изопростанов отмечается у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
Изопростаны, прежде всего F2-изопростаны (F2-isoP), а также изофураны являются основным продуктом неферментативного перекисного окисления липидов (ПОЛ) – полиненасыщенных жирных кислот клеточной мембраны. И если циркулирующие в крови изопростаны через некоторое время выводятся из организма с мочой, то промежуточные продукты их синтеза еще долго обнаруживаются в сосудистом русле. К ним относятся четыре региоизомерных ряда F2-IsoP – 5-, 8-, 12- и 15-F2-IsoP, а также iPF2α-VI, iPF2α-IV, iPF2α-V и iPF2α-III соответственно. Также следует учитывать, что изопростан F2 может быть синтезирован в организме не только из арахидоновой кислоты, но и быть продуктом ПОЛ эйкозапентаеновой или докозагексановой кислот.
Поскольку определение уровней F2-IsoP и их метаболитов может быть полезно для оценки эффективности клинических методов лечения, направленных на снижение оксидативного стресса и воспаления, целью исследования было выявить влияние терапии диосмином на уровень изопростанов (8- изо‑15 (R) -PGF2α; 8-изо-PGF2α; 11β-PGF2α; 15 (R) -PGF2α) у пациентов с ХВН.
Исследование
Реактивы
Стандартизированные изопростаны, включая 8-iso-prostaglandin F2α (8-iso-PGF2α, 8-isoP), 8-iso‑15(R)-prostaglandin F2α, (8-iso‑15(R)-PGF2α, 8,15-isoP), 11β-prostaglandin F2α (11β-PGF2α, 11-isoP), 15(R)-prostaglandin F2α (15(R)-PGF2α, 15-isoP) и дейтерированные внутренние стандарты 8-iso-prostaglandin F2α – d4 (8-iso-PGF2α -d4, I.S.) были закуплены у SPI-BIO (Montigny le Bretonneux, Франция). Ацетонитрил для HPLC-MS был приобретен у Sigma-Aldrich (Польша). Муравьиная и соляная кислоты, а также этилацетат были куплены у P.O.Ch (г. Гливице, Польша). Ультрачистая вода заготавливалась при помощи системы HPLC (Hydrolab, Польша).
Выборка пациентов
Пациенты были отобраны в период с апреля 2014 по февраль 2015 года в отделении сосудистой хирургии и ангиологии Медицинского университета Люблина (Польша). В исследовании приняли участие 47 человек (мужчин – 57,4%, женщин – 42,6%, средний возраст – 61±10,4 года, из них курящих – 29,8%). Исследование было одобрено Независимым этическим комитетом. Критерием включения было наличие ХВН 2-5 степени по классификации CEAP (варикозно расширенные вены – 48,9%, отеки – 36,2%, кожные изменения, обусловленные заболеванием вен, – 10,6%, те же кожные изменения и зажившая язва – 4,3%).
Наличие сопутствующей патологии у пациентов: гипертензия – 44,7%, коронарная болезнь – 6,4%, сахарный диабет – 8,5%, инфаркт – 4,3%. Получали сердечно-сосудистую терапию: β-блокаторами – 10,6%, ацетилсалициловой кислотой – 31,9%, статинами – 10,6%; антидиабетическое лечение – 8,5%. Ни один из пациентов как минимум за 3 мес до исследования не принимал вазоактивные препараты.
Подготовка образцов крови
Кровь у пациентов брали до начала терапии и через 3 мес после ее завершения. Больным был назначен диосмин в дозе 600 мг 2 р./день (препарат Флебодиа производства «Лаборатория Иннотек Интернасьйональ», Франция). Образцы крови собирали в центрифужных пробирках (Sarstedt Monovette EDTA KE, Германия), содержащих ЭДТА (1 мг/мл) и восстановленный глутатион (1 мг/мл). Сразу центрифугировали при 1500 об./мин в течение 10 мин при 4 °C (центрифуга Эппендорфа 5702). 890 мкл плазмы переносили в 2-миллиметровые пробирки Эппендорфа, которые содержали 100 мкл бутилированного гидрокситолуола (200 мкл/мл) для предотвращения окисления, и хранили при -80 °C для дальнейшего анализа.
Выделение изопростанов
К 400 мкл размороженной плазмы было добавлено 4 мл воды, подкисленной соляной кислотой (pH2) и 4 мл этилацетата. Для достижения конечной концентрации 100 пг/мл перед экстракцие дополнительно использовался дейтерированный внутренний стандарт, 8-isoP-d4. Полученную смесь встряхивали в течение 10 мин и центрифугировали 4 мин при 4400 об./ мин. Верхний органический слой дважды собирали и экстрагировали этилацетатом. Затем 8 мл забранного органического слоя выпаривали под слабой струей азота. Сухой остаток повторно растворяли в 400 мкл подвижной фазы и использовали для дальнейшего анализа LC/MS.
Анализ LC/MS
В исследовании была использована система LC-MS8050 Shimadzu, состоящая из двоичного насоса (NEXERA X2 LC‑30 AC), термостата (CTO‑20AC PROMINENCE COLUMN OVEN), автосамплера (NEXERA X2 SIL‑30AC) и тройного квадрупольного масс-спектрометра (Shimadzu, Япония), оборудованного источником ESI, работающим в режиме отрицательных ионов. Для всех анализов использовалась колонка C18 Kinetex, Phenomenex (150×2,1 мм; 2,6 мкм) при поддерживаемой температуре 50 °C.
В качестве подвижных фаз применялись растворы 0,015% муравьиной кислоты в воде (раствор «А») и 0,01% муравьиной кислоты в ацетонитриле (раствор «В»). Использованный градиент: 15% раствора «В» сохраняли в течение 1 мин, затем линейный градиент от 15 до 100% раствора «В» в течение 7 мин. Поток составлял 0,7 мл/ мин, а объем инъекции – 50 мкл. Для сбора данных использовался множественный мониторинг реакции. Количественная оценка проводилась с применением нескольких реакций мониторинга m/z 353,10 → 193,10 для всех изопростанов и 357,20 → 197,10 для 8-iso-простагландина F2α-d4, при сборе и анализе данных использовалось программное обеспечение LabSolutions 5.60 SP1.
Статистический анализ
Статистический анализ результатов (программное обеспечение Statistica 10, StatSoft Polska Sp. z o.o.) проводился с использованием метода описательной статистики со следующими параметрами: размер группы; среднее арифметическое; среднее, минимальное и максимальное значение переменных; стандартное отклонение и средняя стандартная ошибка. Оценка значимости различий между курящими и некурящими проводилась на основании U-критерия теста Манна-Уитни.
Результаты и их обсуждение
Определение уровня F2-изопростана позволяет оценить выраженность оксидативного стресса in vivo и указывает на его роль в патогенезе различных заболеваний. Некоторые литературные данные свидетельствуют о связи между концентрацией изопростанов в крови или моче с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Так, их повышенный уровень по сравнению с контрольной группой отмечается у пациентов с гипертрофической кардиомиопатией (35,4 против 29,9 пг/мл соответственно) и атеросклеротическими поражениями (75,9 и 11,7 пг/мг соответственно).
Диосмин, как и большинство флавоноидов, обладает способностью связывать свободные радикалы и, следовательно, должен снижать концентрацию маркеров оксидативного стресса, таких как изопростаны. Поэтому целью данного исследования было оценить влияние 3-месячного лечения диосмином (2×600 мг) на уровень изопростана у пациентов с ХВН. Для этого определялись значения 4 соединений: 8-изо‑15 (R) -PGF2α, 8-изо-PGF2α, 11β-PGF2α и 15 (R) -PGF2α.
В целом была отмечена высокая вариативность уровней изопростана в исследуемой группе как до начала лечения (Т0), так и после его завершения спустя 3 мес (Т3m). Диапазон значений в точке Т0 составил 0,1-153,8 пг/мл (медиана 24,7 пг/ мл) и в точке Т3m-0,1-118,1 пг/мл (медиана 12,7 пг/мл) соответственно. Среднее значение T0составило 39,65±42,1, уменьшившись в точке Т3m до 23,97±31,3 пг/ мл, что является статистически значимой разницей (рис. 1).
Наиболее выраженные изменения были отмечены для изомеров: 11β-PGF2α и 15 (R) -PGF2. Также была проведена оценка и других показателей, ассоциированных с повышенным риском ХВН (общий холестерин, липопротеины высокой плотности, липопротеины низкой плотности, фракция триглицеридов и индекс массы тела – ИМТ) до и после терапии диосмином, однако их уровни остались неизменными.
В ходе анализа данных отдельных участников исследованиях у 25 было отмечено статистически значимое снижение изопростана. У 12 больных изменения были незначительными, а у 7 их уровень, напротив, повысился до 35 пг/мл. У 3 пациентов был обнаружен аномальный уровень маркера (>93 пг/мл). Однако, вероятнее всего, это была манифестация коморбидного состояния, ассоциированного с оксидативным стрессом.
Из исследуемой группы 14 пациентов были курильщиками, поэтому у них ожидался более высокий, по сравнению с некурящими, уровень изопростанов в крови, поскольку в многочисленных исследованиях было показано, что табачный дым способствует развитию оксидативного стресса за счет образования свободных радикалов и подавления активности антиоксидантов.
По данным разных авторов, уровень свободных и эстерифицированных F2-изопростанов в плазме у курильщиков в 2 раза выше, чем у некурящих, при этом двухнедельный отказ от курения значительно снижает их содержание в крови. Удивительно, но в нашем исследовании разница в обеих исследуемых группах до лечения диосмином не была статистически значимой: среднее содержание маркеров оксидативного стресса у курильщиков и некурящих составляло 42,96±40,3 и 38,25±43,3 пг/мл соответственно.
Также в обеих группах отсутствовали значимые отличия по уровню холестерина в крови и ИМТ. Тем не менее доля пациентов с чрезвычайно высоким уровнем изопростанов (>50 пг/мл) была выше среди курильщиков по сравнению с некурящими (35,7 и 24,2% соответственно). Спустя 3 мес терапии Флебодией концентрация изопростанов в крови у курильщиков значительно уменьшилась (7,74±9,9 пг/мл). У некурящих, в свою очередь, не было отмечено статистически значимых изменений (рис. 2). Способность к снижению уровня оксидативного стресса, спровоцированного никотином, была доказана in vivo и у других флавоноидов, таких как силимарин и нарингенин, а также у антиоксиданта – витамина Е.
Необходимо отметить, что описываемое исследование имеет несколько ограничений, причем наиболее важным является относительно небольшое число пациентов и гетерогенность с точки зрения сопутствующих заболеваний (сахарный диабет, ишемическая болезнь сердца и артериальная гипертензия). Таким образом, влияние коморбидной патологии на окончательные результаты исследования оценить было сложно, но статистически значимых отличий в уровнях изопростанов между больными с коморбидными патологиями и без таковых обнаружено не было. Сильной стороной исследования является тот факт, что все пациенты получали терапию диосмином в соответствии с протоколом, а все полученные результаты были статистически обработаны.
Выводы
В исследовании было изучено изменение уровня изопростанов у больных с ХВН на фоне 3-месячной терапии диосмином. В основной группе наблюдалось статистически значимое снижение концентрации изопростанов в сыворотке крови. Среднее значение в первичной точке составило 39,65±42,1, а через 3 мес уменьшилось до 23,97±31,3 пг/мл. Наиболее значимые изменения наблюдались у курящих пациентов, уровень изопростанов у них снизился с 42,96 до 7,74 пг/мл. Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод о том, что диосмин обладает способностью к снижению оксидативного стресса и может быть с успехом использован в этой когорте пациентов.
Подготовила Ирина Чумак
Тематичний номер «Хірургія, Ортопедія, Травматологія, Інтенсивна терапія» № 3 (33), вересень 2018 р.