Екстракт зеленого чаю як засіб особистої гігієни у профілактиці вірусних інфекцій

Вірусні інфекції продовжують створювати істотну загрозу для громадського здоров’я через можливість розвитку епідемій та пандемій (Nicholson K.G. et al., 2003).  Наприклад, спалах вірусної гарячки Ебола у 2014 р. та глобальна циркуляція пандемічного свинячого грипу (pH1N1) у 2009 р. спричинили численні смерті та госпіталізації (Carroll M.W. et al., 2015; Neumann G. et al., 2009).

Менш небезпечна, ніж гарячка Ебола, норовірусна інфекція, що передається через продукти харчування, також викликає мільйони випадків гострого гастроентериту у всьому світі, які призвели до багатьох госпіталізацій та певної кількості смертей (Goodgame R., 2006). Більшість вірусних хвороб, що виникають в наш час, є зоонозами за своєю природою, що обґрунтовує потребу в підвищенні активності заходів особистої гігієни та створенні дезінфектантів для людей та худоби.

Контроль та профілактика вірусних інфекцій включає вакцинацію, противірусне лікування та заходи особистої гігієни. Вакцинація та противірусні ліки часто вважаються дуже ефективними для запобігання та контролю вірусних інфекцій, однак особиста гігієна є економічно ефективною альтернативою у профілактиці таких хвороб (Aitken C., Jeffries D.J., 2001; Kampf G., Kramer A., 2004). Загалом, особиста гігієна зазвичай включає миття рук за допомогою мила чи антисептика, передусім на основі спирту у зв’язку з його інгібіторною дією на віруси (Greatorex J.S. et al., 2010; Larson E.L. et al., 2012). Однак через швидке випаровування при контакті з повітрям короткий зв’язок зі спиртом (3–95%) виявився неефективним у зниженні активності вірусів (Liu P. et al., 2010). На додачу існує проблема пожежонебезпечності та токсичності антисептиків для рук з високим вмістом спирту (Kramer A. et al., 2006). Більше того, Американський центр контролю та профілактики хвороб (CDC) повідомив, що використання антисептика для рук на спиртовій основі є фактором ризику норовірусної інфекції у закладах довготривалого догляду (Blaney D.D. et al., 2011). Існують також альтернативні антисептики для рук на основі четвертинних сполук амонію, однак їх токсичність та негативний вплив на довкілля дещо обмежують таке використання для особистої гігієни (Dao H. et al., 2012; Xue Y. et al., 2012). Таким чином, існує потреба у розробці ефективних та безпечних для довкілля складників для антисептиків (Hsu S., 2015; Shin W.J. et al., 2012).

Зелений чай (Camellia sinensis) характеризується багатьма сприятливими для здоров’я властивостями (Chacko S.M. et al., 2010; Cabrera C. et al., 2006; McKay D.L. et al., 2002; Sueoka N. et al., 2001). Поліфенольні катехіни зеленого чаю включають галлат епігаллокатехіну (ГЕГK), епігаллокатехін (ЕГК), епікатехін галлат (ЕКГ) та епікатехін (ЕК) (рис. 1), серед яких ГЕГK присутній у найбільшій кількості та здійснює широкий спектр фізіологічних та фармакологічних дій.

ГЕГK in vitro властива противірусна дія родин Retroviridae, Orthomyxoviridae та Flaviviridae включно з такими важливими для людини інфекційними патогенами, як вірус імунодефіциту людини (ВІЛ), вірус грипу А та вірус гепатиту C (Steinmann J. et al., 2013). ГЕГK потужно пригнічує реплікацію вірусу грипу (Song J.M. et al., 2007; Nakayama M. et al.,1993), перешкоджає проникненню в клітину вірусу гепатиту C (Calland N. et al., 2012; Chen C. et al., 2012) та інактивує віруси простого герпесу 1-го та 2-го типу при кислому та нейтральному pH (Isaacs C.E. et al., 2008; 2011). На додачу, ГЕГK здатен блокувати ферментну активність зворотної транскриптази ВІЛ-1 (Li S. et al., 2011). Одним із запропонованих пояснень механізму антивірусної активності ГЕГK є ковалентна модифікація білків цією речовиною у процесі самоокиснення, в ході якого ГЕГK самостійно окиснюється до ГЕГK-хінону, який, у свою чергу, здатен реагувати з нуклеофільною тіоловою групою цистеїнового залишку з утворенням ГЕГK-білкового комплексу (Ishii T. et al., 2008). Більше того, існує думка, що у самоокисненні катехінів задіяні кисневі радикали та молекулярний кисень (Mochizuki M. et al., 2002). Хоча вивченню противірусного впливу екстракту зеленого чаю (ЕЗЧ) чи його очищених катехінових компонентів були присвячені численні попередні дослідження, існує мало інформації стосовно використання цих речовин у створенні дезінфектантів для громадської та особистої гігієни. 

Для практичного застосування у домашніх та польових умовах необхідною є довготермінова стабільність засобу. З метою створення безпечного та дієвого гігієнічного засобу з противірусним ефектом авторами було проведено оцінку противірусного впливу ЕЗЧ у вигляді порошку та розчину протягом тривалого часу при різних температурних умовах. В якості вірусного агента застосовувався вірус людського грипу A/H1N1. 

Матеріали та методи

Клітини лінії MDCK зберігалися у відповідному середовищі при температурі 37 °C, а віруси грипу типу А/Пуерто-Ріко/8/34 (H1N1) культивувалися у курячих ембріонах. ЕЗЧ використовувався у порошковій формі (Song J.M. et al., 2005). Процес екстракції передбачав заливання листя чаю дистильованою водою при температурі 75 °C у співвідношенні 1:7 на 20 хв. Надалі екстракт відділявся від листя шляхом фільтрації та ліофілізувався. Аналіз складу ЕЗЧ за допомогою колонкової хроматографії встановив, що ЕЗЧ містить кофеїн (5,48%), галлову кислоту (0,22%), галлокатехін (1,95%), ЕГК (10,22%), катехіни (0,35%), ГЕГK (9,11%), ЕК (2,51%) та ЕКГ (0,88%). Розчин ЕЗЧ готувався шляхом додавання води до порошку з подальшим фільтруванням. Надалі розчин розводили до концентрації 0,1, 0,05, 0,01 та 0,001%, що зберігалася при різних температурах (4 °C, 25 °C, 37 °C) протягом різного часу. До розчинів ЕЗЧ додавали однаковий об’єм рідини, що містила вірус, та інкубували протягом 6 год при 25 °C , після чого визначали титр вірусу [Jang Y.H. et al., 2016; Jang Y.H. et al., 2013]. Також до розчинів ЕЗЧ додавали 2% лимонну кислоту, 0,1% бензоат натрію та 0,2% аскорбінову кислоту з утворенням суміші, яку надалі досліджували аналогічним методом. Концентрацію катехінів аналізували за допомогою газової  хроматографії.

Результати

Інактивація вірусу грипу під дією ЕЗЧ

Передусім було досліджено збереження антивірусної активності ЕЗЧ після тривалого утримання у різних умовах. Різноконцентровані розчини ЕЗЧ зберігалися при 4 °C, 25 °C та 37 °C протягом 6 год – 56 днів з подальшою перевіркою інактивуючого впливу на вірус грипу А. Результати показали, що 0,05 та 0,1% розчини ЕЗЧ, які зберігалися при 4 °C та 25 °C впродовж 56 днів, вияви­ли потужну вірус-інактивуючу дію, повністю ліквідовуючи здатність вірусів у кількості 106 бляшкоутворючих одиниць (БУО) формувати бляшки. 0,01% розчин ЕЗЧ, що зберігався впродовж 14 днів при 4 °C та 25 °C, також продемонстрував потужну противірусну дію – зниження вірусного титру приблизно у 4 log10 разів. Вірус-інактивуюча дія 0,01% ЕЗЧ при зберіганні більше 14 днів при температурі 4 °C та 25 °C зменшувалася, але все одно зберігалася навіть після 56 днів інкубації. 0,1% розчин ЕЗЧ, що зберігався при 37 °C, і надалі характеризувався вірус-інактивуючими властивостями, хоча після інкубації впродовж 56 днів повного знищення 10⁶ БУО досягнути не вдалось. 0,01% розчин, що зберігався <4 діб, та 0,05% розчин, що зберігався <14 діб при 37 °C, повністю інактивували віруси, однак їх актив­ність зменшувалася у процесі зберігання. 

0,001% розчин ЕЗЧ, що зберігався при 25 °C, продемонстрував низьку вірус-інактивуючу дію (зниження <1 log10) незалежно від часу зберігання. Таким чином, здатність ЕЗЧ інактивувати вірус грипу є залежною від концентрації. Ця здатність поступово знижується при зберіганні розчину >14 діб, особливо у засобів низької концентрації (0,01 та 0,05%). Однак певний обсяг зниження кількості вірусу зберігається і через 56 днів інкубації. Автори зробили висновок, що вірус-інактивуюча дія розчину ЕЗЧ концентрації >0,01% є потужною та стабільною протягом щонайменше 2 міс після приготування навіть в умовах підвищеної температури.

Автори також дослідили дію ЕЗЧ у формі порошку, що зберігався при 25 °C до 16 тижнів. В певні проміжки часу зразки порошку розчиняли у дистильованій воді до 0,1% розчину, який інкубували з 106 БУО вірусу при 25 °C впродовж 6 год. Результати показали, що навіть після 16 тиж зберігання порошок ЕЗЧ повністю інактивував вірус. 

Автори також дослідили вплив на дієвість ЕЗЧ найбільш поширених харчових консервантів: лимонної та аскорбінової кислот, а також бензоату натрію. Результати показали, що протягом першого тижня після додавання цих речовин противірусна активність суміші дещо зменшувалася, однак зберігалася на рівні зниження титру вірусу в 1 6log10 разів в залежності від концентрації. В присутності такого антиоксиданту, як аскорбінова кислота, потужність противірусної дії значно зменшувалася у порівнянні з чистим розчином ЕЗЧ. Зниження противірусної активності сумішей на основі ЕЗЧ було максимальним при відносно короткому терміні зберігання (менше 1 тиж). Однак 0,01 та 0,05% розчини, що утримувалися при 25 °C, відновили свої противірусні властивості через 14 днів зберігання. Подібний феномен було зафіксовано і для розчинів, що знаходилися при температурі 37 °C. Надалі всі розчини зберігали свої властивості до 56 днів інкубації. Отже, було виявлено відмінність між чистим ЕЗЧ та його сумішами з антиоксидантами: в той час як екстра­кт мав найбільш виразну противірусну активність у перші 2 тиж після приготування, а при подальшому зберіганні вона виснажувалась, суміші характеризувалися початковим зменшенням дієвості з подальшим її зростанням та стійким утриманням до 56 днів. Жоден з додатків не продемонстрував власної вірус-інактивуючої дії, що свідчить про те, що пригнічуючий вплив на вірус здійснював виключно ЕЗЧ. Таким чином, хоча антиоксиданти на перших порах дещо знижують противірусну активність ЕЗЧ, вони здатні продовжити термін зберігання дезінфектантів на його основі. При перевірці впливу вищеперерахованих додатків на стабільність катехінів ЕЗЧ було встановлено відсутність будь-якої дії. 

Надалі автори досліджували кінетику інактивації вірусу ЕЗЧ у присутності додатків та за їх відсутності. 0,1% розчини ЕЗЧ та суміші ЕЗЧ з додатками зберігалися при температурі 25 °C протягом 1 дня, а далі інкубувалися з 10⁶ БУО вірусу при 25 °C протягом 0-360 хв. В різні моменти часу бралися зразки суміші та визначався титр вірусу. Інактивація вірусу грипу за допомогою ЕЗЧ була досить швидкою (зменшення вірусного титру у більш ніж 4 log10 рази через 5 хв після інкубації та повна інактивація через 120 хв після інкубації). Застосування суміші ЕЗЧ з антиоксидантними додатками призводило тільки до зниження вірусного титру в 1 log10 через 30 хв і повної інактивації через 360 хв. Це чітко показує, що додатки перешкоджають катехін-опосередкованій інактивації вірусу грипу. На думку авторів, додавання проаналізованих допоміжних речовин призводило до сповільнення виснаження вірус-інактивуючої дії ЕЗЧ, що забезпечує тривале збереження цієї функції діючої речовини.

Кріоелектронна мікроскопія показала, що застосування ЕЗЧ не призводило до достовірних змін у розмірі та формі вірусів, хоча система динамічного розсіювання світла виявила, що інкубація вірусу з ЕЗЧ супроводжувалася зростанням діаметра вірусних частинок на 15,5-28,8%. Враховуючи, що типовий розмір вірусних частинок вірусу грипу становить 80-120 нм (Lamb R.A., Krug R.M., 2001), це збільшення можна вважати незначущим. 

Обговорення

Первинною метою цього дослідження була оцінка ролі ЕЗЧ як потенційного віроцидного дезінфектанта. Автори дослідили стабільність віроцидної активності ЕЗЧ проти вірусу грипу людини A/H1N1 та вплив на неї антиоксидантних додатків. Раніше було встановлено, що катехіни зеленого чаю здійснюють потужний противірусний вплив на ряд людських вірусів включно з вірусами грипу (Song J.M. et al., 2005; Imanishi N. et  al., 2002). Дане дослідження показало, що віроцидна дія ЕЗЧ зберігається до 8 тиж (розчин) та 16 тиж (порошок). Довготривале збереження противірусного ефекту досліджуваного екстракту можна пояснити хімічною стабільністю катехінів (Guo Q. et al., 1999). Вимірювання концентрації катехінів встановило, що істотної відмінності між чистим ЕЗЧ та ЕЗЧ з додатками не було, тобто, на думку авторів, додавання антиоксидантів безпосередньо не впливає на хімічну стабільність катехінів. Вірус-інактивуючі властивості 0,05 та 0,01% ЕЗЧ поступово знижуються впродовж терміну зберігання. Якщо прийняти за аксіому факт, що концентрація катехінів при збереженні залишається сталою, ймовірно, що зменшується ефективність зв’язування їх з білками та мембранами вірусу. Однак точний молекулярний механізм цього потребує подальшого з’ясування.

Було встановлено, що аскорбінова кислота сповільнює опосередковану ЕЗЧ-інактивацію вірусів, напевне, шляхом пригнічення автоокиснення катехінів. Отримані дані свідчать, що потужність віроцидної активності найбільш виразно падає впродовж першого тижня зберігання. Зниження вірусного титру для ЕЗЧ становило 4-6 log10, а для ЕЗЧ з додатками – 1-3 log10. Однак віроцидна активність ЕЗЧ з додатками утримувалася до 8 тиж, в той час як дія чистого ЕЗЧ виснажувалася через 2 тиж. Отже, поєднання ЕЗЧ з таким антиоксидантом, як аскорбінова кислота, призводило до подовження тривалості віроцидної дії. Слід зазначити, що для катехінів зеленого чаю були продемонстровані як анти-, так і прооксидантні властивості (Chen Z.-Y. et al., 1998). Існує точка зору, що катехіни зеленого чаю приєднуються до цистеїнових залишків білків у процесі автоокиснення (Lambert J.D., Elias R.J., 2010; Sang S. et al., 2005). Тому, ймовірно, такий потужний антиоксидант, як аскорбінова кислота, запобігає окисненню поліфенольних OH-груп катехінів до хінонів, що є передумовою приєднання до вірусних білків (Majchrzak D.M.S., Elmadfa I., 2004). Дані цього дослідження показали, що вірус-інактивуюча дія суміші ЕЗЧ з додатками відновлювалася через 14 днів зберігання незалежно від наявності аскорбінової кислоти чи інших допоміжних речовин. Подальше вивчення хімічного та біологічного стану аскорбінової кислоти у суміші з ЕЗЧ під час тривалого зберігання здатне забезпечити пояснення цього феномена. Цікаво, що на противірусну дію 0,1% та менш концентрованих розчинів суміші ЕЗЧ з додатками вплив температури відрізнявся від впливу на чистий ЕЗЧ. При зберіганні при 25 °C противірусна активність 0,1% розчину ЕЗЧ з додатками зменшувалася помірно, в той чай як аналогічні показники 0,05 та 0,01% сумішей різко падали. При зберіганні при 37 °C зниження противірусної активності було більш вираженим для 0,1% суміші, ніж для 0,05 та 0,01%. Хоча зрозуміло, що додавання антиоксидантних допоміжних речовин впливало на кінетику противірусної дії, для з’ясування цього механізму необхідний більш детальний аналіз. Нещодавно було повідомлено, що противірусна ефективність спиртовмісних дезінфектантів на основі сечовини у присутності лимонної кислоти збільшується (Ionidis G. et al., 2016). Ймовірно, що певні додатки здатні збільшувати і стабільність противірусного ефекту ЕЗЧ.

ЕЗЧ характеризується потенційно противірусною дією не тільки на вірус грипу, а й на більший спектр вірусів, в т. ч. парвовіруси (Eterpi M. et al., 2009). Ці дані можуть бути використані у створенні першого засобу особистої та громадської гігієни для зниження розповсюдження вірусних інфекцій. 

Висновки

Дослідження тривалості противірусної дії ЕЗЧ на вірус грипу людини H1N1 показало, що потужна противірусна дія цього рослинного екстракту зберігається при широкому спектрі температур (4-37 °C) протягом 3 міс у вигляді розчину та протягом ще більшого терміну у вигляді порошку. Це свідчить, що противірусні засоби на основі катехінів можуть бути безпечними та нешкідливими для довкілля засобами особистої гігієни. При додаванні аскорбінової кислоти потужність противірусної дії тимчасово зменшується, однак виснаження її відтерміновується, що подовжує тривалість ефективної дії засобу. На противагу більшості противірусних засобів чи синтетичних хімічних речовин, ЕЗЧ не тільки не характеризується жодними обмеженнями з міркувань безпеки, а й виступає сприятливим для здоров’я засобом. Окрім застосування для людей, ЕЗЧ може вживатися для захисту тварин та худоби від вірусних інфекцій та для зниження зоонозної передачі вірусів. До ЕЗЧ можуть додаватися інші компоненти з метою розширення його дії.

Стаття друкується в скороченні.

Lee Y.H., Jang Y.H., KimY.-S., Kim J., Seong B.L. Evaluation of green tea extract as a safe personal hygiene against viral infections. J Biol Eng. 2018; 12: 1.

Перекла з англ. Лариса Стрільчук

Медична газета «Здоров’я України 21 сторіччя» № 18 (439), вересень 2018 р.