14 листопада, 2016

Богатый полифенолами экстракт клубники проявляет биологическую активность против клеток инвазивного рака грудной железы in vitro и in vivo

В последние десятилетия возрос интерес к способности фитохимических веществ модулировать сигнальные пути апоптоза в связи с возможностью их использования в качестве противоопухолевых средств. Фрукты и овощи – наиболее богатые источники этих соединений. Их потребление коррелирует со снижением риска развития хронической патологии, в том числе сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний, ожирения, диабета, инфекционных заболеваний, кожных болезней и рака, включая рак грудной железы (РГЖ). Все большее количество исследователей обращают свое внимание на ягоды, особенно клубнику (Fragaria ananassa Duch. – земляника садовая), в связи с ее ценными пищевыми свойствами и значительным содержанием биологически активных веществ.

Клубника – богатый источник фолиевой кислоты, аскорбиновой кислоты и ряда фитохимических веществ, которые влияют на питательные и органолептические характеристики ягод. Ее целебные свойства принято связывать с высоким содержанием антиоксидантов, большинство из которых – фенольные соединения, такие как антоцианины, флавонолы, конденсированные танины (проантоцианидины, эллаготанины и галлотанины), производные гидроксибензойной и гидроксикоричной кислот и гидролизуемые танины. Противораковое действие биологически активных веществ клубники, по-видимому, реализуется посредством различных механизмов, которые еще недостаточно изучены. Поэтому необходимы дальнейшие исследования для выяснения роли различных фитохимических веществ клубники, оказывающих влияние на раковые клетки.

В ряде работ с использованием экстрактов клубники, малины и других фруктов и ягод не было обнаружено корреляции между содержанием определенных фитохимических веществ и угнетением пролиферации раковых клеток. Действительно, различные исследования показали, что сложные смеси фитохимических веществ в фруктах и овощах более эффективны в профилактике рака, чем их отдельные составляющие, вследствие как аддитивного, так и синергического действия. Именно поэтому очень важно изучать потенциальную противораковую активность фруктов и овощей, используя комплексные экстракты, а не только очищенные вещества или фракции, обогащенные определенными соединениями.

Антиоксидантный потенциал уже давно рассматривают как первую линию защиты на ранних стадиях процессов мутагенеза: антиоксиданты служат ловушками активных форм кислорода, снижая окислительное повреждение ДНК, стимулируя активность антиоксидантных ферментов и способствуя репарации ДНК. В нескольких недавних исследованиях показана способность этих соединений модулировать процессы, связанные с опухолевой прогрессией, такие как клеточная пролиферация и дифференцировка, апоптоз, торможение клеточного цикла, внутриклеточная коммуникация, воспаление и ангиогенез. Тем не менее только единичные работы посвящены противораковому эффекту клубники, в частности при РГЖ. РГЖ – наиболее частое злокачественное новообразование у женщин во всем мире (в 2012 г. выявлено около 1,67 млн новых случаев РГЖ, что составляет 25% всех онкологических заболеваний) и вторая по частоте причина смерти вследствие онкопатологии среди женщин в развитых странах (15,4%, или 198 тыс. смертей).

Существуют убедительные доказательства того, что опухолевый рост, рецидивирование и образование метастазов зависят от клеток, способных к самообновлению, называющихся инициальными или стволовыми опухолевыми клетками (СОК). А17 – высокоагрессивная инвазивная линия клеток, созданная из трансгенной опухоли грудной железы FVB/neuT и проявляющая свойства СОК, а также базальноклеточного РГЖ. Было показано, что А17 проявляют генетические признаки, присущие стволовым клеткам, которые фактически идентичны таковым мезенхимальных стволовых клеток и способны индуцировать вторичные опухолевые поражения путем образования метастазов. В данной работе мы изучали биологическую активность богатого полифенолами экстракта клубники (БПЭК) Alba в отношении РГЖ, преимущественно фокусируясь на клеточной модели А17.

Плоды клубники сорта Alba собирали на экспериментальных полях сельскохозяйственного факультета университета Universita Politecnica delle Marche, находящегося в г. Агульяно, регион Марке, провинция Анкона, в центральной части восточной Италии.

Результаты
Фитохимический анализ БПЭК. С целью изучения состава БПЭК определяли содержание в нем аскорбиновой кислоты и фитохимических веществ, а также общую антиоксидантную способность (ОАС) экстракта. Результаты, приведенные в таблице, показывают (как и в наших предыдущих исследованиях), что в экстракте клубники сорта Alba отмечается высокое содержание аскорбиновой кислоты (0,57 мг/г) и фитохимических соединений (общее содержание фенолов – 2,26 мг ГКЭ/г, флавоноидов – 0,61 мг КЭ/г, антоцианов – 0,46 мг Пг-глкЭ/г).

В то время как значения общего уровня флавоноидов и общего уровня антоцианов были близкими к таковым для других сортов клубники, общее содержание фенолов оказалось очень высоким по сравнению с показателями для ранее исследованных коммерческих сортов клубники.
Более того, проведенная количественная оценка ОАС БПЭК дала релевантные значения как с использованием TEAC- (17,97 мкмоль ТЭ/г), так и с использованием FRAP-анализа (12,62 мкмоль ТЭ/г), что отражено в таблице.

Биологические эффекты БПЭК в отношении клеток А17. Влияние экстракта на выживаемость клеток А17 изучали в дозовой и временной зависимости. Клетки культивировали в течение 24, 48 и 72 ч с различными концентрациями экстракта – от 0,5 до 5 мг/мл. Важно отметить, что, по нашим данным, экстракт снижает выживаемость клеток А17 как во временной, так и в дозовой зависимости (рис. 1а).

Рис. 1. Влияние БПЭК на жизнеспособность клеток Примечание: (а) Эксперименты на клетках А17 для установления дозовой и временной зависимости эффекта. (б) Эксперименты для установления дозозависимости на нормальных клеточных линиях (WI38 и NIH-3T3) и линиях клеток РГЖ (MCF-7 и A17). *р<0,05 по сравнению с нормальными клеточными линиями (критерий Стьюдента).

Кроме клеток А17, активность БПЭК была изучена на клеточных линиях нормальных фибробластов мышей (NIH‑3T3) и человека (WI38), а также на клетках РГЖ человека MCF‑7 в исследованиях дозозависимости через 48 ч культивирования. Обнаружено, что, во‑первых, клетки А17 наиболее чувствительны к воздействию БПЭК (IC50 составляет 1,14±0,29 мг/мл), и, что наиболее важно, во‑вторых, нормальные клетки значительно менее чувствительны к БПЭК по сравнению с линиями опухолевых клеток (среднее значение IC50 – 3,24±0,14 и 1,68±0,77 мг/мл соответственно; рис. 1б).

Затем возможные изменения распределения клеток по фазам митотического цикла были оценены цитофлуориметрическим методом с использованием пропидия йодида. Через 48 ч культивирования клеток А17 в среде с различным содержанием БПЭК наблюдалось сокращение числа клеток в S-фазе и сопутствующее увеличение числа клеток в G1-фазе митотического цикла при концентрациях БПЭК 0,5 и 1 мг/мл. Более того, при культивировании с повышенными дозами БПЭК (2,5 мг/мл) радикально изменялась биологическая реакция клеток А17, затрудняя анализ митотического цикла, но показывая гиподиплоидную клеточную субпопуляцию.

Клеточная линия А17 – привлекательная модель для изучения, поскольку имеет агрессивный и инвазивный фенотип. Учитывая критически важную роль миграции клеток в многоступенчатом процессе тканевой инвазии, мы решили исследовать возможное влияние БПЭК на подвижность клеток А17 методом «раневой поверхности». Чтобы исключить оборот клеток, маскирующий их миграцию, культивирование проводили в голодной среде.

Через 48 ч клетки А17, не подвергавшиеся воздействию экстракта, могли мигрировать и частично заполняли пустое «раневое» пространство, тогда как культивирование с БПЭК сопровождалось дозозависимым ингибированием клеточной миграции. Примечательно, что ингибирование «закрытия раны» отмечалось уже на фоне использования наименьшей концентрации БПЭК (0,5 мг/мл) и оказывалось почти полным при применении 2,5 мг/мл.

Модуляция экспрессии генов под действием БПЭК. Биологический эффект, оказываемый экстрактом на клетки А17, изучали также на молекулярном уровне, анализируя экспрессию панели генов, для которых установлено различное влияние на процессы клеточной миграции, адгезии и инвазии. Для этого определяли уровень 84 различных транскриптов мышиных генов, применяя ПЦР в режиме реального времени (количественную ПЦР), в клетках А17 без воздействия и после 48 ч культивирования с сублетальными дозами БПЭК. Из 84 рассматриваемых генных транскриптов для 12 генов выявлен уровень модуляции, более чем вдвое превышающий значения в контроле (рис. 2а). Из транскриптов генов с down-регуляцией: Csf1 – в 2,42 раза, Mcam – в 2,78 раза, Nr4a3 – в 4,42 раза и SET – в 3,38 раза. Из транскриптов генов с up-регуляцией: Gpnmb – в 4,30 раза, Itgb3 – в 2,97 раза и CCl7 – в 2,89 раза.

Рис. 2. Действие БПЭК на экспрессию генов, участвующих
в процессах миграции, адгезии и инвазии клеток А17
Примечание: (а) Скрининг при помощи ПЦР 84 генов мыши, участвующих
в процессах миграции, адгезии и инвазии (приведены только 66 ампли-
фицированных генов). Дифференциальной экспрессией генов
считали изменение, превышающее двукратное.
(б) Вестерн-блоттинг полных лизатов клеток, полученных из культуры
А17 после воздействия БПЭК или без него.

Кроме того, up-регуляция, превосходящая критерии более чем вдвое, выявлена также для Ctsl (в 2,37 раза), Cxcr4 (в 2,14 раза), Htatip2 (в 2,14 раза) и для матриксных металлопротеиназ 10 и 3 (в 2,62 и 2,61 раза соответственно).

Заметим, что 18 из 84 транскриптов, представленных в ПЦР-матрице, не были амплифицированы (см. легенду рис. 2а).

В дальнейшем при помощи вестерн-блоттинга были исследованы уровни протеинов, кодируемых двумя генами, проявившими наиболее значительную модуляцию, – Mcam и Nr4a3 (рис. 2б). Был проведен денситометрический анализ полос этих двух протеинов с нормализацией на экспрессию альфа-тубулина, подтверждающий down-регуляцию Mcam (-1,89 раза при концентрации экстракта 0,5 мг/мл и -4,25 раза при 1 мг/мл) и в меньшей мере Nr4a3 (-2,37 при концентрации экстракта 0,5 мг/мл и -1,54 раза при 1 мг/мл).

Дополнительный анализ уровня каспазы‑1 при помощи вестерн-блоттинга показал up-регуляцию синтеза протеина как при концентрации БПЭК 0,5 мг/мл (+1,89 раза), так и при 1 мг/мл (+4,16 раза) (рис. 2б).

Оценка активности БПЭК in vivo. Клетки А17 были использованы для создания ортотопической модели РГЖ у сингенных самок мышей линии FVB/N. Грызуны с 4-недельного возраста получали корм, обогащенный до 15% экстрактом клубники; в качестве контроля использовали группу мышей, находящихся на стандартном рационе (по десять особей в каждой группе). По достижении 8-недельного возраста всем мышам прививали опухолевые клетки, продолжая давать такой же корм. Через пять недель опухоли удаляли, измеряли штангенциркулем и взвешивали. Результаты указывали на значительное уменьшение как веса (рис. 3а), так и объема опухоли (рис. 3б) у мышей, которые получали БПЭК.

Рис. 3. Влияние БПЭК на опухоли из трансплантированных клеток А17 у мышей Примечание: Десять мышей, получавших обогащенный до 15% экстрактом клубники корм, содержали по одной в клетке; одновременно десять мышей, получавших обычный корм, содержали в двух клетках со свободным доступом к воде и пище. В возрасте 8 нед всем мышам перевивали по 2×105 клеток А17. Затем все грызуны оставались на прежнем рационе в течение 5 нед, после чего опухоли удаляли и определяли их вес (а) и объем (б). ***р<0,001 (критерий Стьюдента).

Обсуждение
Клубника (Fragaria x ananassa) была выбрана как модель для настоящего исследования благодаря высокому содержанию антиоксидантов и биологически активных соединений, общедоступности для пищевой индустрии и возможности употребления в сыром виде. В последние десятилетия все большее внимание уделяется ОАС клубники, поскольку этот показатель рассматривают как параметр качества и индикатор наличия биологически активных соединений в ягодах. Учитывая антиоксидантные свойства клубники, ее употребление может быть полезным для профилактики и снижения выраженности оксидативных реакций, наносящих вред здоровью человека и служащих одним из механизмов развития хронических заболеваний и рака.

Кроме того, хотя высокий уровень ОАС клубники доказан, на него в значительной мере влияют генетические особенности растения и присутствие таких ловушек радикальных форм кислорода, как аскорбиновая кислота и полифенолы. Антоцианы – количественно наиболее значимые из полифенольных соединений, содержащихся в клубнике, описаны более 25 антоцианиновых пигментов, содержащихся в различных ее сортах и разновидностях. Анализ общего уровня фенолов, общего уровня антоцианов и общего уровня флавоноидов сорта Alba, проведенный в настоящем исследовании, подтверждает высокую концентрацию фитохимических соединений в этих ягодах.

Клубника является ценным источником аскорбиновой кислоты, содержание которой в ней даже выше, чем в цитрусовых. Витамин С принимает участие во многих метаболических процессах в организме человека, снижая риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, ряда форм рака и других патологических состояний, как, например, интоксикация свинцом. При оценке содержания аскорбиновой кислоты в клубнике важно учитывать, что это очень нестабильное вещество, окисляющееся при неблагоприятных условиях, в частности при резком изменении температуры, влажности и рН.

Выбор клубники именно сорта Alba был обоснован очень интересными наблюдениями, полученными недавно при его исследованиях in vitro и in vivo.
Как показано выше, экстракт клубники сорта Alba может значительно снижать выживаемость высокоагрессивной клеточной линии А17, имеющей признаки мезенхимальной трансформации и обладающей способностью к образованию метастазов.

В частности, можно выделить два типа биологических эффектов: цитостатическиподобный (при использовании низких доз БПЭК) и острый токсический (в случае применения высоких доз). В работах ряда авторов также были описаны способность экстракта клубники активировать процесс апоптоза, противоопухолевое действие на других моделях. Тем не менее хотя эти наблюдения согласуются с возрастанием гиподиплоидии, отмеченным в настоящем исследовании при использовании высоких доз БПЭК, но анализ фрагментации ДНК методом линеаризации не выявил индукции апоптического интернуклеосомного расщепления ДНК (данные не приведены). При этом определяли возросший уровень экспрессии прекурсорной формы каспазы‑1, что вместе с отмеченной гиподиплоидией может свидетельствовать об очень ранней стадии активации апоптического пути (ниже порога чувствительности использованных экспериментальных методик). Кроме того, не обнаружено признаков модуляции либо активации каспазы‑3 (данные не приведены).

Мы предположили, что сублетальные дозы экстракта клубники могут ингибировать высокий инвазивный потенциал клеток РГЖ А17, поэтому в первую очередь провели оценку влияния БПЭК на клеточную миграцию методом «раневой поверхности», поскольку известна ключевая роль этого процесса в инвазивности опухолевых клеток. Тот факт, что низкие дозы БПЭК Alba были достаточны для блокирования миграции клеток, навел нас на мысль о необходимости исследований на молекулярном уровне. Последующая характеристика уровня экспрессии генов, участвующих в процессах миграции клеток, адгезии и инвазии, позволила получить общие представления об изменениях, происходящих несколькими путями. В частности, down-регуляция подгруппы генов (Csf1, Mcam, Nr4a3 и Set) свидетельствует в пользу противоинвазивного эффекта БПЭК, поскольку высокий уровень экспрессии этих генов часто сочетается с инвазивным фенотипом клеток. Что касается РГЖ человека, обнаружено, что:

1) высокий уровень экспрессии Csf1 коррелирует с образованием метастазов и поэтому рассматривается как неблагоприятный прогностический фактор;
2) up-регуляция гена, соответствующего Mcam (у человека называемого Muc18), способствует повышению подвижности, инвазивности и опухолегенного потенциала клеток РГЖ человека;
3) высокий уровень экспрессии Nr4a3 сопряжен с увеличением вероятности развития отдаленных метастазов у пациентов с трижды негативным РГЖ;
4) ядерный протоонкоген Set (называемый также I2pp2a) – один из генов с down-регуляцией под действием экстракта гриба Ganoderma lucidum – участвует в супрессии метастазирования РГЖ в легкие. Интересно, что модуляция Mcam и Nr4a3 была также обнаружена на уровне протеинов, дополнительно подтверждая их роль во влиянии БПЭК на клетки А17.

Подобным образом удалось выявить два гена, up-регуляция которых, наблюдаемая вследствие воздействия БПЭК, может сочетаться с противоинвазивным эффектом:
•   Htatip2 (называемый также Tip30) – предположительно ген-супрессор образования метастазов, который проявляет обратную корреляцию с вероятностью метастазирования РГЖ в лимфатические узлы;
•   Gpnmb (Osteoactivin/HGFIN), роль которого в процессе метастазирования неоднозначна.
Напротив, не установлена корреляция между известной активностью остальных шести генов с up-регуляцией под действием БПЭК (Ccl7, Ctsl, Cxcr4, Itgb3,   Mmp19, Mmp3), хотя их функции обычно связывают с приобретением признаков инвазивности.

Как уже отмечалось, роль биологически активных веществ клубники в профилактике рака представляется многоплановой, ученые признают, что механизмы ее действия окончательно не установлены. Предыдущие работы указывают на то, что противоопухолевая биологическая активность ягод, по-видимому, опосредована синергизмом различных веществ, а значит, включает несколько молекулярных путей. На сегодня предпринято лишь несколько попыток исследовать молекулярные основы противоопухолевой активности клубники в отношении клеток РГЖ. Например, недавно изучалась роль p73 в инициации апоптоза р53-нуль клеток. Наша работа указывает на участие других генов в процессах клеточной инвазии, адгезии и миграции.

Главное, что показали исследования выживаемости клеток, – эффект экстракта значительно выше на линиях клеток РГЖ и особенно А17 по сравнению с нормальными клетками, а значит, предполагается наличие терапевтического окна для БПЭК in vivo. Этот результат согласуется с предыдущими экспериментами на мышах, показавшими активность метанольного экстракта клубники в отношении асцитной карциномы Эрлиха. В данной работе изучалась эффективность ингибирования образования опухоли in vivo под действием БПЭК с использованием оригинальной ортотопической модели РГЖ с инъекцией клеток А17 непосредственно в грудную железу мыши. Обнаружено значительное уменьшение как размера, так и массы опухоли у мышей, которым перед трансплантацией опухоли вводили БПЭК начиная с 4-недельного возраста.

Хотя на молекулярном уровне механизм противоракового действия экстракта клубники не полностью ясен, равно как и то, какой из компонентов наиболее важен в плане антинеопластической активности, полученные результаты дают основания предполагать существенную противоинвазивную активность БПЭК Alba в отношении клеток РГЖ как in vitro, так и in vivo. Необходимы дальнейшие исследования для обнаружения путей, участвующих в реализации биологических эффектов БПЭК, освещения молекулярных основ действия экстракта клубники, а также выяснения возможности использования диет, включающих культивар Alba и другие сорта клубники, для подавления (или предупреждения) образования опухоли.

Amatori S., Mazzoni L., Miguel Alvarez-Suarez J. et al.
Polyphenol-rich strawberry extract (PRSE) shows in vitro and in vivo biological activity against invasive breast cancer cells. Scientific Reports 6, 2016.

Статья печатается в сокращении.

Перевел с англ. Геннадий Долинский

Номер: Тематичний номер «Онкологія» № 4 (45), жовтень 2016 р.