13 листопада, 2015
Жидкая биопсия опухоли: за пределами классической гистологии
Низкая эффективность эмпирической терапии рака обусловлена не только его клональной гетерогенностью, но и биологическими отличиями всех участников метастатического каскада. Эти отличия могут проявляться на геномном, эпигеномном и транскриптомном уровнях. Генетическое разнообразие раковых клеток и неудовлетворенность результатами лечения привели к появлению новой терапевтической концепции – индивидуализации лечения, основанной на молекулярном профилировании опухолевой ткани.
Поскольку биология опухоли в процессе лечения постоянно меняется, реализация концепции персонифицированной терапии потребовала новых методов диагностики с целью динамичного контроля болезни. Использования архивного материала биопсии первичной опухоли для этого явно недостаточно, а выполнение повторных биопсий новых висцеральных метастазов при опухолевой прогрессии может быть связано с риском для пациента. Кроме того, следует признать, что биопсия одного участка опухоли не отражает всей сложности ее геномного ландшафта, причиной которого является внутриопухолевая генетическая дивергенция.
Сегодня злокачественную опухоль принято рассматривать как сложную биологическую экосистему, в которой даже незначительные субпопуляции клеток могут усиливать гетерогенность и влиять на рост всей опухоли. В связи с этим интерес вызывает особая фракция циркулирующих в системном кровотоке опухолевых клеток, поскольку именно они ответственны за метастатическую прогрессию.
В экспериментальных моделях было установлено, что ежедневно из 1 г опухолевой ткани в циркуляцию поступает более 1 млн клеток. Однако опухоль выделяет в кровь не только клетки, но и собственные бесклеточные компоненты – циркулирующую опухолевую ДНК, матричную РНК, микроРНК, экзосомы, нуклеосомы, протеины и метаболиты. Одна опухолевая клетка способна выделять в кровь 1 пикограмм (10-12 г) белковых продуктов своей жизнедеятельности в концентрации 200 нг/мл.
Циркулирующие в крови клеточные и бесклеточные компоненты злокачественной опухоли могут быть чувствительными диагностическими, прогностическими и предиктивными онкомаркерами, влияющими на принятие клинических решений. Особенно актуальной эта проблема является при проведении персонифицированного лечения у больных с первичной или приобретенной резистентностью.
Совершенствование методов молекулярной генетической визуализации привело к появлению нового направления диагностики рака, которое лежит далеко за пределами классической гистологии. Все больший интерес у клиницистов вызывает жидкая биопсия (liquid biopsy) – исследование периферической крови онкологического больного. Наиболее перспективными направлениями жидкой биопсии считают обнаружение и фенотипирование циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), изучение молекулярного профиля циркулирующих ДНК и РНК, а также изучение внеклеточного опухолевого протеома и метаболома.
Циркулирующие опухолевые клетки
О наличии ЦОК при раке впервые сообщил T.R. Ashworth еще в 1869 г. (Aust. Med. J.14, 146-149, 1869). Многочисленные попытки изучить эту фракцию опухолевых клеток долгое время были безуспешными из-за отсутствия соответствующих технологий их обнаружения в крови.
На протяжении двух последних десятилетий разработаны новые методики, которые позволили с высокой точностью, чувствительностью и специфичностью идентифицировать раковые клетки в системном кровотоке. Это существенно расширило наши знания о ранних и поздних стадиях канцерогенеза, а также позволило рассматривать ЦОК в качестве чувствительных прогностических, предиктивных и фармакодинамических онкомаркеров.
Причиной, которая заставляет раковые клетки мигрировать (метастазировать), является их внутриопухолевая конкуренция.
Раковые клетки развиваются в сложных условиях иммунного контроля, гипоксии и ацидоза. Во время дефицита ресурсов и постоянного давления внешней среды опухоль использует стратегию эволюционного компромисса – увеличивает скорость деления клеток, но производит при этом многочисленное и дефектное потомство, неспособное к конкуренции. Максимальная скорость роста численности за счет непрерывной рождаемости называется «r»-стратегией природного размножения живых организмов. Эта стратегия необходима для обеспечения численности вида в экстремальных условиях окружающей среды (E. Wilson).
Недифференцированная раковая клетка в условиях быстрой «r»-стратегии способна только «повторять, повторять, повторять». Для выживания клеток включаются соответствующие механизмы: отмена точек check-point в клеточном цикле, укорочение фазы G1, подавление репарации ДНК, метаболическое перепрограммирование (анаэробный гликолиз и ускоренная пролиферация даже в условиях ацидоза). Все это приводит к еще большему истощению ресурсов, поиску нового микроокружения и миграции.
Процесс метастазирования начинается с потери клетками эпителиальных и приобретения мезенхимальных антигенов (эпителиально-мезенхимальный переход), снижения адгезивных свойств, разрушения базальной мембраны и интравазации.
Эпителиальные клетки в кровотоке имеют короткую выживаемость – большинство из них погибают в течение нескольких минут, попадая в «капиллярную ловушку» и превращаясь в апоптотические тельца. Этому способствуют гемодинамический стресс и взаимодействие с клетками иммунной системы. Апоптотические тельца не могут реализоваться в виде гематогенных метастазов, но зато они являются источником циркулирующих опухолевых ДНК и РНК – важных участников метастатической прогрессии. Этот феномен описан ниже.
Выжившие немногочисленные ЦОК экспрессируют факторы, ингибирующие апоптоз и аноикоз (одна из форм апоптоза, когда смерть клетки наступает при нарушении адгезии и взаимоотношений с матриксом). Эти клетки изменяют свои гемодинамические и метаболические свойства и могут обнаруживаться в кровотоке как в виде единичных клеток, так и в виде циркулирующих опухолевых микроэмболов. Выжившие циркулирующие клетки обладают высоким метастатическим потенциалом.
Трафик ЦОК разнонаправленный. Эти клетки вначале попадают в преметастатическую нишу костного мозга, а затем, обогащенные цитокинами и факторами роста, мигрируют в периферическую нишу висцеральных органов, реализуясь со временем в гематогенные метастазы, или возвращаются в микроциркуляторное русло первичной опухоли, способствуя ее росту.
Методы идентификации ЦОК в крови
Сложности идентификации ЦОК состоят в том, что 1 опухолевая клетка окружена примерно 10 млн лейкоцитов и 5 млрд эритроцитов.
Для обогащения и детекции ЦОК используют их физические отличия от клеток крови (размер, плотность, электрический заряд) или же биологические особенности (экспрессию определенных мембранных рецепторов или цитозольных белков).
Поскольку опухолевые эпителиальные клетки имеют значительно больший размер, чем лейкоциты и эритроциты, они могут быть обнаружены с помощью микрофильтрации (используются полиуретановые фильтры с диаметром пор менее 30 мкм). Технология их выявления (которая используется также на кафедре онкологии ДЗ «ЗМАПО МОЗ Украины») включает такие этапы, как цитаферез с высоким коэффициентом центрифугирования, седиментацию, дезагрегацию клеток и лизис эритроцитов. После детекции ЦОК подвергаются цитологическим, цитоморфометрическим и иммуноцитохимическим исследованиям. На рисунках 1-4 представлены ЦОК различного фенотипа (исследования выполнены на кафедре онкологии ДЗ «ЗМАПО МЗ Украины»).
Для обнаружения ЦОК в периферической крови на основании их биологических характеристик чаще других используют маркер эпителиальной адгезии (EpCAM), для чего применяют различные коммерческие и экспериментальные технологии: CellSearch, MagSweeper, GILUPI cell collector, CTC chip, Herringbone chip, AdnaTest, IsoFlux.
Клиническое значение ЦОК
ЦОК могут быть использованы в качестве прогностических и предиктивных биомаркеров, а также с целью скрининга, выявления минимальной остаточной опухолевой болезни и для мониторинга заболевания.
Управление по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных средств США (FDA), Министерство здравоохранения и социальных служб США рекомендуют использовать подсчет количества ЦОК в качестве прогностического маркера при раке грудной железы (РГЖ), раке предстательной железы (РПЖ) и колоректальном раке (КРР). Прогноз заболевания определяют количеством клеток (от 3 до 8) в 7,5 мл периферической крови (золотым стандартом считается метод CellSearch®). У больных с немелкоклеточным раком легкого количество ЦОК может достигать 50 в 7,5 мл крови.
В процессе проведения химиотерапии или таргетной терапии в качестве фармакодинамических маркеров целесообразно использовать всю фракцию ЦОК или некоторые субпопуляции с определенными молекулярными характеристиками (экспрессию HER2, EGFR1, IGFR). Снижение фракции ЦОК может свидетельствовать об эффективности противоопухолевого лечения, повышение фракции ЦОК во время химиотерапии – о безуспешности этой линии и необходимости использовать другие препараты. Повышение количества ЦОК в процессе лечения ассоциируется с более короткой выживаемостью у больных РГЖ, РПЖ и КРР.
Анализ количества ЦОК позволяет идентифицировать тех пациентов, которые наиболее выиграют от проведения адъювантной терапии.
Получены обнадеживающие результаты об использовании молекулярного профилирования ЦОК в качестве предиктивных маркеров для персонифицированной терапии.
Примерами такого подхода являются изучение в ЦОК активирующих мутаций EGFR при немелкоклеточном раке легкого для терапии некоторыми ингибиторами тирозинкиназы или изучение в ЦОК мутаций EML4-ALK, при которых отмечается выраженный эффект от терапии ALK-ингибиторов.
Известно, что экспрессия HER2 при РГЖ в клетках первичной опухоли и метастазах может отличаться в 30-40% случаев. Принято считать, что наличие экспрессии HER2 в ЦОК является основанием для проведения анти-Erb-терапии, даже в случаях HER2-негативной первичной опухоли.
Считается также оправданным проведение персонифицированной терапии, ориентированной на определение экспрессии рецепторов андрогенов в ЦОК при РПЖ.
Циркулирующая опухолевая ДНК
Впервые циркулирующую в крови ДНК обнаружили P. Mandel и P. Metais еще в 1948 г., однако это открытие не привлекало внимание онкологов вплоть до 1994 г.
Небольшое количество свободной внеклеточной ДНК в кровотоке обнаруживают в физиологических условиях у здоровых людей, а также при доброкачественных опухолях, травме и воспалении. При раке и во время опухолевой прогрессии количество циркулирующей ДНК в крови резко возрастает. В этих случаях пул циркулирующей ДНК представлен опухолевым и неопухолевым компонентами.
Высвобождение фрагментов ДНК в циркуляцию происходит при некрозе, апоптозе и во время секреции опухолевых клеток. Источником циркулирующей ДНК при раке может быть первичная опухоль, метастазы, а также ЦОК и микрометастатические колонии клеток в костном мозге и висцеральных органах.
Установлено, что из опухоли массой 100 г (3×1010 клеток) ежедневно в кровь поступает 3,3% всей опухолевой ДНК. В среднем размер опухолевой ДНК варьирует от небольших (70-200 пар оснований) до крупных фрагментов (21 000 пар оснований), достигая концентрации 1000 нг/мл (у здоровых субъектов средняя концентрация циркулирующей ДНК составляет 30 нг/мл).
Циркулирующие нуклеиновые кислоты имеют период полураспада от 15 минут до нескольких часов. Двухцепочечные фрагменты ДНК живут дольше; вирусная ДНК, имеющая замкнутое кольцо, может прожить в кровотоке дольше линейной ДНК; микроРНК обладает высокой стабильностью.
Механизм удаления ДНК из циркуляции до конца не ясен. Разрушение внеклеточной ДНК происходит системой ДНКаз, а элиминация продуктов деградации осуществляется через печень и почки.
Получены интересные свидетельства о возможной интеграции внеклеточной циркулирующей ДНК в геном здоровых клеток-реципиентов. Этот феномен лег в основу геннометастатической теории опухолевой прогрессии, описывающей злокачественную трансформацию здоровых клеток отдаленных органов за счет горизонтального переноса (трансфекции) доминирующих онкогенов бесклеточной ДНК первичной опухоли в клетки преметастатической ниши. Возможно, что впоследствии именно эти клетки реализуются в виде гематогенных метастазов.
При опухолях различных гистогенетических подтипов пул циркулирующих нуклеиновых кислот состоит из эпигеномной, геномной, митохондриальной и вирусной ДНК.
Поскольку опухоли представлены смесью различных клонов злокачественных и доброкачественных клеток, в кровотоке может появляться ДНК как дикого (нормального), так и мутантного типа. Одна и та же опухоль может выделять в кровоток различные ДНК. В них могут быть обнаружены как генетические (мутации, делеции, амплификации), так и эпигенетические события (метилирование, микросателлитная нестабильность).
Для отделения из общего пула циркулирующей ДНК именно опухолевых нуклеиновых кислот требуется изучение характерных опухольспецифических генных мутаций, являющихся доказательством принадлежности ДНК и РНК к клеткам первичной опухоли. Следует учитывать, что характерные опухольассоциированные мутации и другие генетические аберрации в небольших количествах могут встречаться и у здоровых лиц при отсутствии рака (в частности, у курильщиков).
При опухолях, зависимых от вирусного канцерогенеза (раке носоглотки, полости рта, шейки матки; гепатоцеллюлярной карциноме; лимфомах) в крови онкологических больных обнаруживается циркулирующая вирусная ДНК (ВПЧ, вирус Эпштейна-Барр, вирус гепатита В).
Одна соматическая клетка содержит в среднем 500 митохондрий и постоянное количество митохондриальной ДНК. Повышение числа копий и мутаций генов в митохондриальной ДНК в крови легко обнаружить. Обычно эти мутации ассоциированы с раком ободочной кишки, мочевого пузыря, опухолей головы-шеи, легких, грудной железы, почек и яичек.
Фрагменты ДНК циркулируют в кровотоке в виде нуклеосом.
Нуклеосомы
Нуклеосома состоит из структурной части хромосомы и некоторых гистоновых белков, «упакованных» совместно в микропузырек фрагментом клеточной мембраны. Именно благодаря нуклеосомам опухолевая ДНК сохраняет в кровотоке все особенности ядерного хроматина клеток первичной опухоли.
Само по себе повышение концентрации нуклеосом в крови не является признаком злокачественности, так как часто встречается и при доброкачественных опухолях.
Поступление нуклеосом в кровоток в большом количестве происходит во время массивного апоптоза раковых клеток, что наблюдается в больших и быстро пролиферирующих опухолях, а также после химиотерапии.
Доказано, что в процессе проведения цитотоксической химиотерапии мониторинг концентрации нуклеосом в крови является ранним и чувствительным тестом эффективности лечения.
Доказана также диагностическая и прогностическая полезность выявления циркулирующей ДНК некоторых вирусов при раке соответствующей локализации (исследования проведены в Гонконге, Тайване и Китае, где вирусассоциированные опухоли являются превалирующими).
Циркулирующая матричная РНК и микроРНК
Кроме циркулирующей опухолевой ДНК, в сыворотке и плазме крови онкологических больных обнаруживаются матричные РНК и микроРНК, которые, наряду с ДНК и белками, являются основными внутриклеточными макромолекулами.
Впервые микроРНК (класс небольших некодирующих молекул РНК) были обнаружены в 2008 году в сыворотке крови больного крупноклеточной В-клеточной лимфомой.
Зрелые микроРНК состоят из 19-25 нуклеотидов. 50% всех человеческих микроРНК локализованы в участках хромосом, в которых обнаруживаются делеции и транслокации.
В целом, микроРНК играют важную роль в регуляции экспрессии генов в раковых клетках. На примерах рака легкого, рака яичника, РГЖ, КРР доказано, что микроРНК участвуют в регуляции различных клеточных процессов, таких как апоптоз, пролиферация, эпителиально-мезенхимальный переход и метастазирование.
Несмотря на большое количество расщепляющих ферментов, циркулирующая РНК очень стабильна, поскольку «упакована» в экзосому.
Экзосомы
Экзосомы – это микроскопические (30-100 нанометров) внеклеточные везикулы, выделяемые в межклеточное пространство раковыми (и не только) клетками. Мембрана экзосом образуется в результате впячивания внутрь эндосомальной мембраны, а полость экзосом представлена частью цитоплазмы клетки. Кроме РНК в полости экзосомы находятся белки, липиды и ДНК. В одном микролитре плазмы крови человека содержится до 3 млн экзосом.
Основными функциями экзосом являются осуществление межклеточной коммуникации, горизонтальная передача генетического фенотипа, участие в неклассической секреции белков. Появляются новые данные об участии экзосом в развитии и метастатической прогрессии злокачественных опухолей.
Обнаружение и идентификация циркулирующей ДНК и РНК могут иметь важное научное и клиническое значение.
Для обнаружения опухольассоциированных мутаций в фрагментах циркулирующей ДНК и мРНК используют такие методики, как секвенирование нового поколения (NGS), полимеразную цепную реакцию (PCR), MAP (MIDI-Activated Pyrophosphorolysis), масс-спектрометрию. Чувствительность этих методов очень высока, хотя повсеместное их использование в клинике ограничено стоимостью и техническими трудностями внедрения молекулярных методик в рутинную практику врачей-онкологов.
Циркулирующая ДНК как клинический онкомаркер
Определение циркулирующей опухолевой ДНК имеет прогностическое и предиктивное значение, а также позволяет предсказать рецидив заболевания и развитие резистентности во время проведения противоопухолевой терапии.
Несмотря на то что процесс изучения роли циркулирующих микроРНК в метастатической прогрессии только начался, уже сегодня можно сделать заключение о перспективности такого подхода в контексте появления нового биологического онкомаркера.
Прогноз и риск рецидива
У больных с резектабельными опухолями после потенциально радикального лечения с помощью молекулярного анализа циркулирующей ДНК можно с высокой вероятностью диагностировать минимальную остаточную опухолевую болезнь, выявить опухоль покоя и предсказать риск рецидива.
Наличие опухоли покоя является характерной чертой большинства видов рака. Эти спящие клетки (непролиферирующие микрометастазы) невозможно обнаружить стандартными методами радиологической визуализации. Присутствие в крови циркулирующей опухолевой ДНК указывает (при отсутствии видимых маркерных очагов) на наличие невидимых раковых клеток. Установлено, что после условно радикальной резекции специфические генетические аберрации в виде циркулирующей опухолевой ДНК сохраняются в крови до 12 лет. Если учесть, что период выведения ДНК из кровотока составляет в среднем 30 мин, можно сделать вывод, что наличие ДНК в крови отражает факт наличия минимальной остаточной опухолевой болезни в виде дремлющих микрометастазов в периферической нише. Именно во время некроза, апоптоза и секреции дремлющих опухолевых клеток их ДНК попадает в кровоток. Следует отметить, что сегодня нет ни одного клинического и радиологического метода, кроме определения циркулирующей ДНК, позволяющего подтвердить факт наличия опухоли истинного покоя – непролиферирующих микрометастазов в периферической нише.
По имеющимся данным, послеоперационный мониторинг опухольспецифических аберраций (АРС, ТР53, KRAS) в плазме больных с КРР позволяет прогнозировать рецидив заболевания в 100% случаев. Эти генетические события наблюдаются у всех больных с остаточной опухолью.
При поздних стадиях и неоперабельном раке проведение количественной оценки уровня нескольких опухольассоциированных генетических мутаций, присутствующих в циркулирующей ДНК, является более чувствительным прогностическим маркером, чем определение отдельных специфических генетических аберраций в тканях опухоли.
Предиктивные маркеры и резистентность
При проведении персонифицированной терапии рака с использованием таргетных препаратов сегодня ориентируются на наличие предиктивных молекулярных маркеров, присутствующих в тканях первичной опухоли (HER2, EGFR, KRAS, BRAF, ALK, KIT, PDGFR).
Однако известно, что однократная биопсия и молекулярное профилирование первичной опухоли не позволяют полностью изучить генетический ландшафт опухолевой ткани во время прогрессии.
При позднем рецидиве архивные образцы тканей не могут быть использованы для принятия клинических решений. В такой ситуации следует выполнить повторную биопсию нового, быстро растущего метастаза.
Однако сегодня существуют неоспоримые доказательства того, что в качестве предсказания ответа на терапию более чувствительными являются предиктивные онкомаркеры, изученные в ЦОК и в циркулирующей опухолевой ДНК.
Исследования показали, что генетические аберрации в крови, ассоциированные с наличием резистентных клонов клеток в опухоли (метастазах), позволяют предсказать устойчивость к терапии на 10 мес раньше, чем появятся клинические и радиологические признаки резистентности (Recist).
Оценка генетического ландшафта опухоли
В отличие от биопсии тканей, жидкая биопсия опухоли позволяет представить всю панораму молекулярных событий и генетических мутаций, полученную из всех участков опухоли (первичная локализация, метастазы, ЦОК, опухоль покоя), а не из ее отдельного участка.
Кроме того, проведение повторных жидких биопсий, не представляя клинической проблемы, позволяет оценивать клональную эволюцию опухоли под давлением таргетной терапии.
Примером такого подхода является анализ генетической дивергенции у пациентов с BRAF V600E мутантной меланомой в процессе терапии вемурафенибом. Многократными периодическими исследованиями мутаций в циркулирующей опухолевой ДНК во время прогрессии были обнаружены несколько механизмов приобретенной резистентности: гиперэкспрессия MAP3K8, активация пути МАРК, усиление активности PDGFRβ, появление BRAF truncated, амплификация или мутация NRAS Q61K.
Скрининг панели соматических мутаций в циркулирующей опухолевой ДНК дает возможность идентифицировать редкие мутации (например, мутации в KIT при РГЖ, которые происходят в 1% случаев, позволяют проводить эффективное, хотя и нестандартное лечение таких больных).
ЦОК и циркулирующая ДНК как дополняющие биомаркеры
Прогресс в области молекулярной биологии, в частности совершенствование методов секвенирования ДНК, вызвал дискуссию о том, какие циркулирующие онкомаркеры периферической крови являются более предпочтительными в клинике – ЦОК или ДНК.
Было проведено прямое сравнение (head tо head) циркулирующих онкомаркеров у 30 больных РГЖ с соматическими мутациями PIK3CA и TP53. Циркулирующая ДНК с подобными молекулярными аберрациями была выявлена у 97%, ЦОК – у 87% больных. При прогрессировании заболевания повышение уровня ДНК в крови наблюдалось у всех больных, в среднем за 5 мес до констатации клинической и радиологической прогрессии. Повышение количества ЦОК во время прогрессии наблюдали менее чем у 40% больных. Сделан вывод, что оба сывороточных маркера (ЦОК и ДНК) коррелируют с ответом на лечение и прогнозом, однако циркулирующая опухолевая ДНК демонстрирует более широкий динамический диапазон с точки зрения фармакодинамического мониторинга.
С одной стороны, изучение мутационного пейзажа циркулирующей опухолевой ДНК имеет преимущества – простота и чувствительность современных методик. С другой стороны, методы идентификации ЦОК в периферической крови постоянно совершенствуются. Современные платформы позволяют не только облегчить процедуру поиска и обогащения клеток, но и предоставить дополнительную информацию в виде оценки морфологии клеток, их фенотипа; дают возможность устанавливать наличие множественных мутаций в одной клетке и в целом изучать индивидуальную эволюцию злокачественного клона. Современные технологии позволяют также объединить анализ мутаций генов с профилированием мРНК.
Таким образом, на практике циркулирующая ДНК является более предпочтительной для изучения мутаций, а ЦОК обеспечивает возможность изучить особенности биологии метастатической прогрессии и выявить новые функциональные мишени для таргетной терапии, особенно у больных, резистентных к проводимой терапии.
Сочетание обоих маркеров является предпочтительным.
Заключение
Оценка прогноза заболевания у онкологического пациента основана на клиническом стадировании, а также на гистологической и молекулярной характеристиках первичной опухоли. При развитии резистентности к терапии каждому пациенту показано выполнение повторной биопсии с молекулярным профилированием тканей новых опухолевых очагов. Тактика, базирующаяся на анализе генетических изменений в клетках во время прогрессии, позволяет осуществлять лечение на основании принципов персонифицированной терапии.
Проведение повторных инвазивных биопсий висцеральных метастазов не всегда выполнимо в клинических условиях из-за риска для пациентов. К тому же молекулярный анализ тканей из одного участка опухоли не отражает всей ее генетической гетерогенности.
Процесс метастазирования проявляется выделением в кровь большого количества ЦОК и бесклеточных опухолевых компонентов (ДНК, мРНК, экзосом, нуклеосом, белков и метаболитов), которые сегодня расцениваются как высокочувствительные ранние диагностические, прогностические, предиктивные и фармакодинамические онкомаркеры.
Доступность биологического материала, широкие возможности современных методов молекулярной визуализации позволяют рассматривать жидкую биопсию опухоли (обнаружение и фенотипирование ЦОК, а также выявление мутаций в циркулирующей ДНК) в качестве обязательного рутинного теста клинической онкологии.
Перспективным является поиск новых белковых сывороточных онкомаркеров и циркулирующих метаболитов опухолевых клеток.
