Моноклональные антитела и иммуноцитохимические методы в диагностике В-клеточных неходжкинских лимфом

Неходжкинские лимфомы (НЛ) – гетерогенная группа опухолей, возникающих из различных типов клеток лимфоидной ткани. С учетом клинико-гематологических проявлений различают НЛ с преимущественным поражением лимфатических узлов разной локализации, первично экстранодальные и диссеминированные, или лейкемические.
НЛ относятся к тем немногим формам опухолей, смертность от которых в последние десятилетия продолжает неуклонно расти. По данным Национального ракового института США, 5-летняя выживаемость взрослых больных с НЛ составляет немногим более 50%.
По данным Национального канцер-регистра Украины, в 2012 г. НЛ были выявлены у 2671 больного. Заболеваемость НЛ у мужчин в том же году составила 4,8, у женщин – 3,2 на 100 тыс. населения, а смертность – 3,8 и 2,1 на 100 тыс. населения соответственно. Анализ статистических данных 2005-2007 гг. показывает, что 28% пациентов с НЛ умерли на протяжении первого года после установления диагноза, а 5-летняя выживаемость составила 48,8%.
НЛ диагностируются на основе гистологического изучения материала биопсии лимфатического узла или экстранодальных очагов поражения. Результаты исследования срезов, окрашенных гематоксилин-эозином или по Романовскому-Гимзе, позволяют определить вид новообразования, характер роста (диффузный или нодулярный), провести дифференциальную диагностику с метастазами низкодифференцированных опухолей, воспалительными процессами, реактивно-гиперпластическими изменениями. При уточненном выделении отдельных форм и вариантов НЛ важным является цитологическое изучение отпечатков удаленных при биопсии лимфатических узлов.
Основным преимуществом современной классификации лимфом является принцип морфоиммунологических сопоставлений. Основываясь на этом принципе, все лимфомы подразделяются на опухоли из клеток-предшественников и опухоли из периферических (зрелых) иммунокомпетентных клеток.
На практике из НЛ выделяют те разновидности новообразований лимфоидной ткани, которые встречаются наиболее часто, в частности диффузную В-крупноклеточную лимфому (31%), фолликулярную лимфому – ФЛ (22%), хронический лимфолейкоз – ХЛЛ (7%) и лимфогранулематоз (лимфому Ходжкина). Также к широко известным лимфоидным опухолям следует отнести MALT-лимфому (8%) и лимфому из клеток мантийной зоны (6%).
Более 90% НЛ имеют В-клеточное происхождение, и большинство из них представлены опухолями из периферических (зрелых) лимфоидных клеток.

Классификация ВОЗ 2008 г. (табл. 1) представляет собой список (перечень) основных иммуноморфологических вариантов лимфом с указанием наиболее вероятного нормального аналога злокачественных клеток.
Лимфомы, которые возникают из клеток, находящихся на разных уровнях дифференцировки, и из разных микроанатомических зон периферических лимфоидных органов, имеют уникальные иммунофенотипические характеристики. По-видимому, именно они в совокупности с некоторыми биологическими признаками опухоли (пролиферативная активность, признаки апоптоза и др.) определяют особенности клинического течения, реакции на лечение и прогноз. Таким образом, современная диагностика злокачественных лимфопролиферативных заболеваний с учетом новой классификации ВОЗ должна основываться на результатах клинических, патогистологических, иммуногистохимических исследований, данных цитоморфологического исследования периферической крови и пунктатов костного мозга, дополненных данными иммунофенотипирования клеток, а для уточненной диагностики в сомнительных случаях – данными молекулярно-генетического анализа.
При проведении иммунодиагностики лимфом устанавливается иммуноподвариант лимфомы (в рамках морфоиммунологического диагноза), оценивается степень распространенности процесса (лейкемизация, поражение костного мозга), констатируется наличие или отсутствие минимальной резидуальной болезни.
В-клеточные лимфомы представляют собой клональную пролиферацию В-клеток на разных стадиях (уровнях) дифференцировки, начиная от костномозговых клеток-предшественников до зрелых плазматических клеток. Во всех вариантах они в определенном смысле повторяют путь нормальной В-клеточной дифференцировки в костном мозге и за его пределами в периферических органах иммунной системы. Действительно, даже перечисление форм и цитологических вариантов В-клеточных НЛ в соответствии с клеточным субстратом опухоли (лимфобластный, лимфоцитарный, центроцитарный, центробластный, иммунобластный, плазмобластный и т.д.) подтверждает сказанное.
В последние годы стало очевидным, что изучение соматических гипермутаций, происходящих в генах вариабельных областей тяжелых цепей иммуноглобулинов клеток зародышевых (герминальных) центров вторичных лимфоидных фолликулов периферических органов иммунной системы, имеет не только научное, но и практическое значение. Сведения о мутационном статусе VH-генов позволяют определить уровень дифференцировки B-клеток по отношению к герминальным центрам фолликулов, в том числе и при злокачественных лимфомах (префолликулярные и постфолликулярные этапы созревания).
В соответствии с этими данными НЛ по происхождению лимфоидных клеток, составляющих субстрат опухоли, условно подразделяются на три группы. Опухоли из B-клеток прегерминальных, герминальных (внутрифолликулярных) и постгерминальных этапов дифференцировки.
К опухолям из B-клеток прегерминальных (префолликулярных) этапов дифференцировки относятся лимфобластные и мантийноклеточные лимфомы.
Герминальное происхождение имеют ФЛ и лимфома Беркитта (ЛБ). Гены вариабельных областей тяжелых цепей иммуноглобулинов в опухолевых клетках содержат множество соматических гипермутаций. Этот механизм не выключается, и «накопление» мутаций приводит к «внутриклоновой» гетерогенности.
К опухолям, имеющим постгерминальное (постфолликулярное) происхождение, относятся лимфомы из клеток маргинальной зоны и лимфоплазмоцитарные.
При В-лимфоцитарной лимфоме/ХЛЛ неопластические клетки могут иметь как прегерминальное (из наивных B-клеток), так и постгерминальное происхождение. Этот вопрос в последние годы является предметом глубоких молекулярно-биологических и клинических исследований. При диффузной В-крупноклеточной лимфоме (ДВКЛ) также прослеживается гетерогенность в происхождении опухолевых клеток, составляющих субстрат болезни. Клетки могут иметь как герминальное (фолликулярное), так и постгерминальное происхождение. Все эти данные имеют важное прогностическое клиническое значение.
Принципы диагностики В-клеточных НЛ. В большинстве случаев диагноз злокачественной НЛ можно заподозрить на основании рутинного морфологического анализа. Иммуногистохимические методы с использованием моноклональных антител (мкАТ) позволяют верифицировать диагноз лимфомы на основании монотипии клеточных элементов лимфатического узла, моноклональности или аберрантного иммунофенотипа клеток.
Наибольшую сложность представляет дифференциальный диагноз группы морфологически сходных периферических В-клеточных мелкоклеточных лимфом, к которым, в соответствии с классификацией ВОЗ (2008), относятся В-ХЛЛ/лимфома из малых лимфоцитов (ЛМЛ), лимфома из клеток мантии, ФЛ, лимфома маргинальной зоны (ЛМЗ), лимфоплазмоцитарная лимфома (ЛПЛ).
В последние годы получены важные данные о механизмах, лежащих в основе возникновения многих В-клеточных НЛ. Среди них выделяют НЛ, ассоциированные с инфекционными агентами (H. pylori, вирус гепатита С, вирус Эпштейна-Барр – ВЭБ), опухоли, возникновение которых связано с нарушениями регуляции клеточного цикла или апоптоза, обусловлено изменениями регуляции клеточных сигналов и транскрипции, лимфомы, ассоциированные с врожденной или приобретенной чувствительностью организма к определенным антигенным воздействиям, посттрансплантационные и другие ятрогенные НЛ.
Выявлены также специфические молекулярно-генетические аномалии, использующиеся в современной классификации и диагностике В-клеточных НЛ (табл. 2).

Ниже приведена цитоморфологическая, иммунофенотипическая и цитогенетическая характеристика некоторых форм лимфом из зрелых В-клеток.

Хронический лимфолейкоз/лимфома из малых лимфоцитов
В-клеточный ХЛЛ/ЛМЛ – опухоль, состоящая из мономорфных малых нестимулированных лимфоцитов с примесью пролимфоцитов и параиммунобластов, в норме располагающихся в первичных фолликулах или в мантийной зоне вторичных фолликулов лимфоидной ткани и образующих центры пролиферации в тканевых инфильтратах в костном мозге, селезенке и лимфатических узлах. На клетках ХЛЛ/ЛМЛ обычно отмечается экспрессия антигенов CD5 и CD23.
Пациенты с ХЛЛ/ЛМЛ составляют около 10% онкологических больных. Термин ЛМЛ используется для нелейкемических случаев с морфологическими изменениями в тканях и иммунофенотипом ХЛЛ. Клетки ЛМЛ имеют низкий митотический индекс.
В соответствии со стандартами Международного рабочего совещания, проведенного Национальным институтом рака США, для установления диагноза ЛМЛ необходимы наличие у больного лимфаденопатии, отсутствие цитопении, вызванной инфильтрацией костного мозга лимфоцитами, и количество В-клеток в периферической крови <5×10⁹/л.
Цитоморфология. При гистологическом исследовании при малом увеличении микроскопа отмечается типичная архитектура лимфатического узла, представленная скоплениями (пластами) малых лимфоцитов, не отличимых от нормальных лимфоцитов, занимающих В-зоны лимфоидной ткани. Во многих случаях при этом выявляются светлые нодулярные участки, или псевдофолликулы, что создает проблемы при диагностических исследованиях. Внутри этих псевдофолликулов находятся клетки с центрально расположенными ядрышками (пролимфоциты) и параиммунобласты.
Очень редко больные с ХЛЛ/ЛМЛ при наличии поражения лимфоидной ткани выявляются в алейкемической фазе. Обычно же эволюция заболевания связана с нарастающим поражением костного мозга и появлением патологических клеток в периферической крови. При исследовании мазков периферической крови больных ЛМЛ обнаруживались преимущественно клетки с признаками малых лимфоцитов (I группа). Наряду с этим у части пациентов (II группа) 30-40% клеток составляли лимфоциты среднего размера с более светлым ядром и широким ободком цитоплазмы. Определялись клетки типа пролимфоцитов (до 10%). У III группы больных, наряду с малыми и средней величины лимфоидными клетками, обнаруживались часть клеточных элементов с невысокой базофилией цитоплазмы, пролимфоциты (>10%) и немногочисленные бластоподобные клетки.
Иммунофенотип. У 85-90% больных ХЛЛ/ЛМЛ на поверхностных мембранах лимфоидных клеток экспрессируется IgM и почти у 50% пациентов – одновременно и IgD. Реакция при выявлении поверхностных иммуноглобулинов, как правило, выражена слабее, чем на В-лимфоцитах в норме. На поверхностных мембранах патологических клеток определяется только один тип легких цепей иммуноглобулинов – κ или λ. У некоторых больных тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов одного и того же класса (подтипа) могут выявляться и в цитоплазме клеток.
Клетки при ХЛЛ/ЛМЛ экспрессируют ассоциированные с В-лимфоцитами антигены CD19, CD20, CD24, CD79a. Экспрессия антигена CD20 выражена слабее, чем на нормальных В-клетках. В преобладающем большинстве случаев определяется маркер активированных В-клеток CD23, и только у небольшого числа больных – антиген CD22, считающийся маркером покоящихся зрелых В-лимфоцитов.
Важным иммунофенотипическим признаком клеток при В-ХЛЛ является экспрессия у более чем 90% больных антигена CD5, обычно выявляющегося на Т-клетках и считающегося их специфическим маркером. У пациентов с ЛМЛ при отсутствии лейкемизации частота выявления CD5 лишь немногим выше 50%.
У 10% больных В-ХЛЛ, у которых не обнаруживается экспрессия CD5, чаще отмечаются изолированная спленомегалия и более выраженная экспрессия тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Клиническое течение заболевания и медиана выживаемости пациентов с данным подтипом заболевания не отличаются от обычно наблюдаемых.
На поверхностных мембранах клеток при В-ХЛЛ определяется экспрессия антигена CD43, а у ряда больных – более высокая, чем в норме, экспрессия белка bcl-2. При отсутствии мутаций генов вариабельных участков иммуноглобулинов (IgHV) в клетках при В-ХЛЛ наблюдается положительная реакция при иммуноцитохимическом выявлении антигена CD38. Одновременно экспрессия циклина D1 и антигена CD23 используется в дифференциальной диагностике ХЛЛ/ЛМЛ и НЛ из клеток мантии. Однако клетки при В-ХЛЛ в некоторых случаях могут быть CD23-отрицательными, а при НЛ из клеток мантийной зоны может выявляться экспрессия антигена CD23.

В-пролимфоцитарный лейкоз
В-пролимфоцитарный лейкоз (В-ПЛЛ) был впервые описан в 1974 г. как вариант ХЛЛ. В-ПЛЛ – редкое заболевание, встречающееся несколько чаще у мужчин, чем у женщин. Средний возраст пациентов (70 лет) на 6-7 лет превышает таковой у больных В-ХЛЛ.
У большинства пациентов с В-ПЛЛ определяется выраженная спленомегалия при отсутствии увеличения лимфатических узлов. Количество лейкоцитов в периферической крови нередко превышает 100×10⁹/л. Почти у половины больных выявляется анемия и тромбоцитопения. В ряде случаев в сыворотке крови определяется М-компонент.
Цитоморфология. При В-ПЛЛ лейкемические клетки обнаруживаются в периферической крови, костном мозге и селезенке. Большинство циркулирующих в крови клеток (55-90%) представлены пролимфоцитами. Это крупные клетки, диаметр которых в два раза превышает размер лимфоцитов, с округлыми ядрами с умеренно конденсированным хроматином, содержащими одно центрально расположенное ядрышко. Лейкемические клетки имеют достаточно широкий ободок светло-голубой цитоплазмы.
Костный мозг при В-ПЛЛ гиперклеточный, с высоким содержанием лимфоидных клеток типа пролимфоцитов.
Цитохимия. Характерной, имеющей дифференциально-диагностическое значение, является реакция при определении активности тартрат-резистентной кислой фосфатазы. В клетках при В-ПЛЛ определяется умеренная диффузная окраска цитоплазмы, не исчезающая при добавлении в инкубационную среду ингибитора – виннокислого калия-натрия в концентрации 0,05 М.
Иммунофенотип. У большинства больных В-ПЛЛ на поверхностных мембранах клеток крови и костного мозга наблюдается выраженная экспрессия IgM с или без IgD, В-клеточных антигенов CD19, CD20, CD22, CD79a и CD79b. Положительная реакция при выявлении антигенов CD5 и CD23 отмечается только в 20-30 и 10-20% случаев соответственно. Экспрессия ZAP-70 выявляется у 57%, а антигена CD38 – у 46% больных и не связана с мутационным статусом генов иммуноглобулинов.

Волосатоклеточный лейкоз
Волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ) – необычная форма опухолевых заболеваний лимфоидной ткани. Составляет около 2% всех лимфоидных лейкозов. Чаще встречается у людей в возрасте старше 40-50 лет. Мужчины болеют в 4-5 раз чаще, чем женщины. Отличительные признаки ВКЛ – наличие спленомегалии, миелофиброза, панцитопении, присутствие в костном мозге и периферической крови лейкемических клеток с волосистыми, или ворсинчатыми, отростками.
При лабораторном исследовании крови выявляется анемия, как правило, нормоцитарная, нормохромная. В 70% случаев наблюдается тромбоцитопения (содержание тромбоцитов <100×10⁹/л) и лейкопения (количество лейкоцитов <1,5×10⁹/л). В мазках крови больных при микроскопическом исследовании обнаруживаются лимфоидные клетки с волосистыми отростками, содержание которых в лейкограмме колеблется в широких пределах. Постоянным признаком является моноцитопения.
Цитоморфология. Инфильтрирующие селезенку, костный мозг и циркулирующие в периферической крови больных ВКЛ клетки несколько более крупного размера, чем при В-ХЛЛ, с умеренно широкой бледно-голубой или более базофильной цитоплазмой с характерными волосистыми отростками. Структура хроматина ядра умеренно плотная, ядрышки нечетко контурируются или отсутствуют.
Цитохимия. Основным диагностическим признаком лейкемических клеток при ВКЛ является интенсивная окраска цитоплазмы при цитохимическом определении активности тартрат-резистентной кислой фосфатазы. Помимо ВКЛ, устойчивая к действию ингибитора, но менее выраженная активность данного фермента определяется только у больных В-ПЛЛ и ЛМЗ. Резистентная к действию ионов тартрата (при добавлении в инкубационную среду 0,05 М виннокислого калия-натрия) кислая фосфатаза соответствует изоферменту 5, определяемому при электрофорезе в полиакриламидном геле.
Иммунофенотип. В большинстве случаев ВКЛ на поверхностных мембранах лейкемических клеток наблюдается умеренная или выраженная реакция при выявлении иммуноглобулинов (чаще – IgM или IgM+IgD, иногда – IgG или IgA). У некоторых больных иммуноглобулины определяются в цитоплазме клеток. Классический иммунофенотипический профиль клеток при ВКЛ – коэкспрессия антигенов CD20, CD22 и CD11c. Помимо этого, при иммуноцитохимическом исследовании обнаруживается экспрессия антигенов CD103, CD25, CD123. Определяется слабая реакция с мкАТ к циклину D1. В большинстве случаев на лейкемических клетках при ВКЛ не обнаруживаются антигены CD10 и CD5.  Наиболее специфическим маркером клеток при ВКЛ является аннексин А1, который не экспрессируется при различных типах В-клеточных НЛ.

Лимфома маргинальной зоны селезенки
Существует три клинико-морфологические разновидности ЛМЗ: ЛМЗ селезенки, лимфатического узла и экстранодальная ЛМЗ, ассоциированная с лимфоидной тканью слизистой оболочки (MALT-лимфома).
ЛМЗ селезенки (ЛМЗС), называвшаяся также лимфомой селезенки с циркулирующими ворсинчатыми лимфоцитами, встречается редко и составляет до 2% всех лимфоидных новообразований (рис. 1). Лейкемизация при ЛМЗС отмечается значительно чаще, чем при других формах ЛМЗ. Поэтому ЛМЗС ранее нередко диагностировалась как один из цитологических подвариантов ХЛЛ. Соотношение мужчин и женщин среди больных ЛМЗС составляет 1:1. Возраст большинства пациентов превышает 50 лет.

Рис. 1

Клинико-гематологические признаки. Для большинства больных характерным является наличие спленомегалии, сочетающейся с аутоиммунной тромбоцитопенией и анемией. В патологический процесс вовлекаются лимфатические узлы у ворот селезенки, печень и костный мозг. Поражение периферических лимфатических узлов наблюдается нечасто. Количество лейкоцитов в периферической крови, как правило, не выходит за границы нормальных показателей или несколько повышено. В редких случаях оно превышает 25×10⁹/л. Почти у четверти больных отсутствует абсолютный лимфоцитоз. При исследовании мазков крови определяется варьирующее количество лимфоцитов с ворсинчатыми отростками. У 30% пациентов при исследовании сыворотки крови определяется умеренная моноклональная гаммапатия IgM типа, в редких случаях – IgD типа. Лимфаденопатия и наличие экстранодальных очагов поражения не относятся к характерным признакам заболевания.
Иммунофенотип. На поверхностных мембранах опухолевых клеток определяется экспрессия IgM и часто, но не во всех случаях, – IgD. Положительная реакция при выявлении антигена CD79b отмечается у 75% больных. Не экспрессируются на клетках ЛМЗС антигены CD5, CD10, CD23, CD43. Отсутствие циклина D1 (а также у большинства больных – антигена CD5) используется в дифференциальной диагностике лимфоидных новообразований, позволяя исключить лимфому из клеток мантийной зоны (МКЛ) и В-ХЛЛ. Отсутствие экспрессии антигена CD10 и белка bcl-6 может быть использовано для дифференциации ЛМЗС и ФЛ.

Лимфоплазмоцитарная лимфома
ЛПЛ диагностируется преимущественно у пожилых лиц. Средний возраст заболевших, среди которых преобладают мужчины, составляет 63 года (возрастной диапазон от 32 до 92 лет).
Опухоль состоит из малых В-лимфоцитов, лимфоцитов с признаками плазматизации и плазматических клеток. ЛПЛ характеризуется преимущественным поражением костного мозга, в 15-30% случаев – лимфатических узлов, селезенки и печени. Возможно также развитие экстранодальных очагов поражения (легкие, органы желудочно-кишечного тракта, кожа), появление патологических клеток в периферической крови.
Циркулирующие в крови клетки представляют собой малые лимфоциты с признаками плазматизации (выраженной базофилией цитоплазмы и эксцентрично расположенным ядром). У многих больных при исследовании белков сыворотки крови обнаруживается моноклональная гаммапатия (IgM – в 60%, IgG – в 30%, IgA – в 5% случаев). Наличие повышенного содержания IgM в сыворотке крови (более 30 г/л) и в цитоплазме лимфоплазмоцитарных клеток костного мозга определяет развитие синдрома, известного как макроглобулинемия Вальденстрема.
Цитохимия. При цитохимическом исследовании в лимфоплазмоцитоидных клетках при ЛПЛ отмечается интенсивное диффузное окрашивание цитоплазмы при проведении PAS-реакции. При выявлении активности кислой фосфатазы и кислой неспецифической эстеразы наблюдается умеренное диффузное окрашивание цитоплазмы клеток. Активность миелопероксидазы, хлорацетатэстеразы и щелочной фосфатазы в субстратных клетках при данном типе лимфом не выявляется.
Иммунофенотип. При иммуноцитохимическом исследовании на поверхностных мембранах клеток костного мозга и клеток, циркулирующих в периферической крови, обнаруживается экспрессия иммуноглобулинов: чаще – IgM (при отсутствии IgD), иногда – IgG и в редких случаях – IgA. Иммуноглобулины соответствующего класса обнаруживаются также в цитоплазме плазматических клеток. На поверхностных мембранах субстратных клеток экспрессируются ряд ассоциированных с В-клетками антигенов (CD19, CD20, CD79a) и антиген CD38. Плазматические клетки являются CD138-положительными. В некоторых случаях наблюдается слабое окрашивание поверхностных мембран клеток при взаимодействии с мкАТ к антигенам CD25 и CD11c. Отмечается варьирующая экспрессия антигенов CD22 и CD23. Не обнаруживаются антигены CD5, CD10, CD103. Отсутствие CD5 на опухолевых клетках наблюдается не у всех больных. Одновременное выявление Ig в цитоплазме клеток в этих случаях позволяет дифференцировать ЛПЛ и В-ХЛЛ/ЛМЛ.

Фолликулярная лимфома
ФЛ относится к числу наиболее распространенных опухолей лимфоидной ткани, занимая второе место после ДВКЛ. На долю ФЛ приходиться около 20% всех лимфом и около 70% индолентных форм, диагностирующихся в США и в странах Западной Европы. В Восточной Европе, Азии и развивающихся странах частота ФЛ ниже. Средний возраст больных в момент установления диагноза составляет 60 лет, при соотношении мужчин и женщин 1:1,7.
Цитоморфология. В подавляющем большинстве случаев ФЛ имеет фолликулярный (нодулярный) характер роста. Фолликулы, образованные неопластическими клетками, в гистологических препаратах часто трудно определить, так как в них отсутствует мантийная зона. ФЛ состоит из двух типов клеток зародышевых центров лимфоидных фолликулов – центроцитов и центробластов.
Распространено подразделение ФЛ с учетом их клеточного состава на три категории (степени): преимущественно из малых клеток (1 степень), смешанная из малых и крупных клеток (2 степень) и преимущественно из крупных клеток (3 степень).
Иммунофенотип. На поверхностных мембранах неопластических клеток при ФЛ выявляются иммуноглобулины – чаще IgM (одновременно с или без IgD). Экспрессируются ассоциированные с В-клетками дифференцировочные антигены CD19, CD20, CD22, CD79a. На поверхностных мембранах клеток выявляются антигены bcl-2, bc-l6 и CD10. Этим ФЛ отличаются от МКЛ. Как правило, не обнаруживаются антигены CD5 и CD43. В некоторых случаях, особенно при ФЛ степени 3Б, может отсутствовать антиген CD10, но сохраняется экспрессия bcl-6. Экспрессия CD10 чаще выражена сильнее, чем на клетках, располагающихся интерфолликулярно. На опухолевых клетках, выявляющихся в костном мозге и периферической крови, она может вообще отсутствовать. Экспрессия белка BCL2 обнаруживается на варьирующей части клеток у 50% больных с ФЛ степени 3.
У большинства больных с ФЛ диагноз устанавливается в развернутой стадии заболевания. При этом поражение костного мозга отмечается у 40-70% пациентов. У многих больных с помощью иммуноцитохимических маркеров клетки ФЛ могут быть обнаружены в периферической крови. В ряде случаев лейкемизация процесса отмечается уже в момент установления диагноза. При этом в большинстве случаев обнаружения в периферической крови клона CD20⁺CD10⁺CD5^- клеток ассоциируется с индолентным клиническим течением.

Лимфома из клеток мантийной зоны
МКЛ составляет 6% всех НЛ. Встречается преимущественно у лиц пожилого или среднего возраста (соотношение мужчин и женщин 2:1). У большинства больных выявляется в III-IV стадии заболевания. Характеризуется наличием лимфаденопатии, гепато- и спленомегалии, поражением костного мозга в более чем 60% случаев. Изменения в периферической крови при использовании проточной цитофлуориметрии определяется у 65% пациентов. У некоторых из них может выявляться выраженный лимфоцитоз, подобный таковому при пролимфоцитарном лейкозе. У ряда больных могут обнаруживаться очаги экстранодального поражения (Вальдейерово кольцо, множественный лимфоматоидный полипоз с вовлечением тех или иных участков слизистой оболочки органов желудочно-кишечного тракта).
Цитоморфология. Лимфома состоит из малых или среднего размера клеток с округлым или неправильной формы ядром и узким ободком бледно окрашивающейся цитоплазмы. Хроматин более дисперсный, чем в малых лимфоцитах в норме, ядрышки плохо различимы (рис. 2). Иногда неопластические клетки имеют более крупные размеры (типа бластоидных или лимфобластоидных) или являются полиморфными (типа бластоидного, из полиморфных клеток и из клеток с обширной светлой цитоплазмой – моноцитоидных В-клеток).

Рис. 2

Иммунофенотип. Клетки МКЛ, в том числе и выявляемые в костном мозге и периферической крови при лейкемизации процесса, дают положительную реакцию с мкАТ к антигенам CD19, CD20, CD24 и CD79b. На поверхностных мембранах клеток определяется выраженная или умеренная экспрессия IgM/IgD. Обязательным является наличие антигена CD5. Реакция на антиген CD23 отрицательная. Положительная реакция отмечается при выявлении антигена CD43. Не экспрессируются антигены CD10 и белок bcl-6. Антигены CD11c, CD25 и CD103 на поверхностных мембранах клеток при МКЛ не выявляются. Устанавливаемый с помощью иммунологических маркеров типичный фенотип клеток МКЛ – CD20⁺CD5⁺CD23^-. В редких случаях определяется атипический иммунофенотип – CD20⁺CD5^-CD23^- или CD20⁺CD5⁺CD23⁺.
Уникальной для клеток МКЛ, даже для редких случаев CD5-отрицательных лимфом этого типа, является обусловленная транслокацией t(11; 14) усиленная экспрессия циклина D1 (белка, участвующего в регуляции клеточного цикла) и повышенная активность циклин D1-зависимой киназы. Положительная реакция с мкАТ к циклину D1 используется в качестве маркера для распознавания МКЛ in situ и при проведении дифференциальной диагностики с ФЛ, ЛМЛ и В-клеточным ХЛЛ.

Диффузная В-крупноклеточная лимфома
ДВКЛ – опухоль из крупных клеток В-лимфоидного происхождения (рис. 3). Встречается чаще у пожилых людей (средний возраст – 60-70 лет), но может диагностироваться и в молодом возрасте, и у детей. У больных обнаруживаются быстро увеличивающиеся в размерах опухолевидные образования (солитарные или множественные) лимфатических узлов. Почти 40% ДВКЛ являются экстранодальными с первичной локализацией в коже, центральной нервной системе, костях скелета, яичках, легких, почках, печени, щитовидной железе, слюнных железах.

Рис. 3

Цитоморфология. ДВКЛ, составляющие 20-30% всех НЛ, характеризуются диффузным характером роста. В очагах поражения выявляется пролиферация крупных лимфоидных клеток, сопровождающаяся полным или частичным стиранием архитектуры лимфатического узла. Поражение лимфатических узлов может быть также интерфолликулярным, с вовлечением синусов, наличием очагов склероза.
Выделяют ряд цитоморфологических вариантов ДВКЛ. Особого внимания заслуживают опухоли, состоящие из клеток среднего размера. При их диагностике требуется исключить очаги экстрамедуллярного гемопоэза при лейкозах, вариантах ЛБ и представленной бластоидными клетками МКЛ.
Как правило, распознают три наиболее частых морфологических варианта ДВКЛ (центробластный, иммунобластный и анапластический) и несколько минорных.
Иммунофенотип. На неопластических клетках при ДВКЛ отмечается экспрессия пан-В-клеточных антигенов CD19, CD20, CD22 и CD79a. Но при этом один или несколько из указанных антигенов могут не выявляться при иммуноцитохимическом исследовании. В 50-70% случаев на поверхностных мембранах и/или в цитоплазме опухолевых клеток обнаруживаются иммуноглобулины того или иного класса (IgM, IgG, IgA). При этом не отмечается корреляции между наличием иммуноглобулинов в цитоплазме клеток и экспрессией таких маркеров плазматических клеток, как антигены CD38 и CD138.
Поражение костного мозга, выявляемое в момент установления диагноза ДВКЛ, служит показателем неблагоприятного прогноза (уровень 5-летней выживаемости не превышает 10%). Вовлечение в патологический процесс костного мозга, выявляемое в более позднем периоде, не оказывает существенного влияния на течение заболевания (средний уровень 5-летней выживаемости – 62%).
У пациентов с ДВКЛ дифференциальный диагноз на основе изучения препаратов костного мозга проводится с другими типами В-крупноклеточных лимфом, метастазами мезотелиомы (отсутствует экспрессия В-клеточных антигенов, выявляются цитокератины), с лимфомой Ходжкина, при которой на клетках выявляется экспрессия антигенов CD30 и CD15.

Первичная В-крупноклеточная лимфома средостения (тимуса)
ДВКЛ средостения, возникающая из исходных В-клеток тимуса, имеет ряд отличительных клинических, иммунофенотипических и генотипических признаков. На ее долю приходится 2-4% всех форм НЛ.
Цитоморфология. Лимфомы данного типа представлены клеточными элементами с широким спектром цитоморфологических признаков. Обнаруживаются клетки средних или крупных размеров с округлыми или овальными ядрами и широкой светлой цитоплазмой.
Иммунофенотип. На неопластических клетках экспрессируются В-клеточные антигены – CD19, CD20, CD22 и CD79a и не выявляются иммуноглобулины. Почти у 80% больных на клетках отмечается слабая или умеренная реакция при выявлении антигена CD30, а у 70% – антигена CD23. В 50-80% случаев обнаруживается экспрессия bcl-2, bcl-6 и очень редко – CD10.

ALK-положительная В-крупноклеточная лимфома
Опухоль состоит из ALK-положительных мономорфных крупных иммунобластоподобных клеток. Относится к числу крайне редких. Очаги поражения обнаруживаются преимущественно в лимфатических узлах, реже – в средостении. Иногда выявляются очаги экстранодального поражения (носоглотка, желудок, кости, мягкие ткани).
Цитоморфология. Опухоль представлена мономорфными крупными клетками с округлыми светлыми ядрами с крупными нуклеолами и широким ободком цитоплазмы. В некоторых случаях определяются признаки плазмобластной дифференцировки, выявляются атипичные многоядерные гигантские неопластические клетки.
Иммунофенотип. В клетках лимфомы наблюдается выраженная положительная реакция при иммуноцитохимическом определении белка ALK. В цитоплазме клеток в большинстве случаев определяются иммуноглобулины (как правило, IgA, реже – IgG) с одним типом легких цепей. У всех больных выявляется экспрессия эпителиального антигена EMA, обнаруживаемого также на клетках при множественной миеломе, и антигена CD38. Опухолевые клетки являются также CD57- и CD4-положительными. На их поверхностных мембранах не были выявлены антигены CD19, CD20, CD22, CD79a, CD23 и CD3. В одном из трех случаев определяется общелейкоцитарный антиген CD45.

Плазмобластная лимфома
Плазмобластная лимфома (ПБЛ) представлена диффузной пролиферацией крупных неопластических клеток, большинство из которых напоминают иммунобласты, но имеют иммунофенотипические признаки плазматических клеток. Относится к числу редких форм лимфом, встречающихся преимущественно у ВИЧ-инфицированных лиц мужского пола. Средний возраст заболевших – около 50 лет.
Цитоморфология. ПБЛ включают спектр клеток, напоминающих иммунобласты или имеющих признаки плазмоцитарной дифференцировки. В последнем случае необходимо проведение дифференциальной диагностики с анапластической или плазмоклеточной лимфомой. Часто обнаруживаются фигуры митоза, клетки с признаками апоптоза.
Иммунофенотип. Клеточные элементы опухоли имеют плазмоклеточный иммунофенотип (положительная реакция при выявлении антигенов CD138, CD38 и IRF4/MUM1). Экспрессия антигена CD79a на патологических клетках обнаруживается в 50-85% случаев. При выявлении антигенов CD45, CD20 и PAX5 реакция отрицательная или слабо положительная. Внутрицитоплазматические иммуноглобулины (преимущественно IgG с κ- или γ-легкими цепями) выявляются у 50-70% пациентов с ПБЛ. Часто определяется экспрессия антигенов EMA и CD30.

Первичная лимфома экссудатов
В-крупноклеточная опухоль с почти исключительным поражением серозных полостей с развитием плевральных, перикардиальных и перитонеальных экссудатов. Иногда экстранодальные инфильтраты из неопластических клеток с подобными морфологическими и иммунофенотипическими признаками обнаруживаются в легких, коже, органах желудочно-кишечного тракта.
Цитоморфология. Обнаруживаемые в цитоцентрифужных препаратах из экссудатов неопластические клетки имеют цитоморфологические признаки иммунобластов или плазмобластов, в ряде случаев – с признаками анаплазии. Ядра клеток крупные, округлые или неправильной формы, с выраженными нуклеолами. Цитоплазма клеток широкая и интенсивно базофильная, иногда вакуолизированная. Могут обнаруживаться редкие многоядерные клетки, напоминающие клетки Рид-Штернберга.
Иммунофенотип. В неопластических клетках экспрессируется антиген CD45 и не выявляются пан-В-клеточные маркеры, такие как антигены CD19, CD20 и CD79a. Отсутствуют поверхностные и внутрицитоплазматические иммуноглобулины, bcl-6. Определяются активационные и связанные с плазматическими клетками маркеры и некоторые другие антигены, такие как HLA-DR.

Лимфома Беркитта
ЛБ – опухоль В-клеточной природы с преимущественной экстранодальной локализацией. Состоит из мономорфных среднего размера трансформированных клеток, для которых характерной, но неспецифической является транслокация гена MYC.
Различают три варианта ЛБ, в основе которых лежат отличительные биологические и клинико-морфологические признаки: эндемическая ЛБ; ЛБ спорадического типа; ЛБ, ассоциированная с иммунодефицитом. Последний из вариантов ЛБ обнаруживается в сочетании с ВИЧ-инфекцией и нередко служит начальным проявлением синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа). При ЛБ эндемического типа у всех пациентов в большинстве неопластических клеток обнаруживается геном ВЭБ, который определяется у 30% больных со спорадической ЛБ. При варианте ЛБ, ассоциированном с иммунодефицитом, ВЭБ выявляется у 25-40% пациентов.
Цитоморфология. Опухолевые клетки средних размеров. При ЛБ эндемического и спорадического типа они имеют общие цитоморфологические признаки. Ядра клеток округлые с нежной структурой хроматина, содержат множественные ядрышки. Цитоплазма клеток интенсивно базофильная, содержит жировые вакуоли (рис. 4). В составе опухолей определяется высокая фракция пролиферирующих клеток. Одновременно выявляется большое количество клеток с признаками апоптоза.

Рис. 4

При изучении гистологических срезов определяется картина «звездного неба». Среди тяжей из клеток с выраженной базофилией цитоплазмы выявляются немногочисленные макрофаги.
Иммунофенотип. На поверхностных мембранах клеток при ЛБ определяются IgMg или IgMl и экспрессируются ассоциированные с В-клетками антигены (CD19, CD20, CD22, CD10, CD38, CD77, CD43). Как правило, в ядрах клеток не выявляется TdT, отмечается слабая или отрицательная реакция при определении bcl-2.
Заключение. Основным методом диагностики НЛ было и остается гистологическое (иммуногистохимическое) изучение срезов лимфатических узлов и биоптатов из экстранодальных очагов поражения. При ряде форм В-линейных НЛ уже в начальной стадии заболевания или при прогрессировании процесса неопластические клетки могут обнаруживаться в составе инфильтратов в костном мозге или циркулировать в периферической крови.
Их обнаружение основано на использовании классических цитологических, цитохимических и новых иммунофенотипических признаков, ставших известными после широкого применения мкАТ – специфических реагентов для выявления линейно-специфических и дифференцировочных антигенов В-лимфоцитов.
Как показывают результаты проведенного исследования, данные цитологического и иммуноцитохимического исследования клеток крови и пунктатов костного мозга могут быть использованы для установления предварительного диагноза тех или иных форм В-клеточных НЛ.