Лабораторные методы оценки функциональной активности тромбоцитов и их клиническое значение

Актуальность нарушений гемостаза обусловлена не столько их широкой распространенностью, сколько потенциально высокой опасностью для жизни человека. В настоящее время насчитывается около 200 дефектов системы гемостаза, при этом у 50 млн человек в мире они имеют первичный характер (2/3 случаев – изменения со стороны тромбоцитарного звена).

История открытия и изучения тромбоцитов

Первые сведения о тромбоцитах в научной литературе появились более 150 лет назад. Порой высказывались достаточно курьезные предположения относительно того, что тромбоциты образуются из лейкоцитов, при распаде лимфоцитов, в результате синтеза бактериями, как производные фибрина, а также представляют собой артефакт, наблюдаемый in vitro (табл. 1).

В процессе многолетних исследований функций тромбоцитов было показано, что они играют существенную роль в таких важных для организма процессах, как первичный гемостаз, регуляция сосудистого тонуса, воспаление, реализуют защитное влияние и др. (рис. 1).

Согласно современным представлениям тромбоциты образуются в результате мегакариоцитопоэза, происходящего в костном мозге. В процессе созревания мегакариоцит проходит 3 стадии: мегакариобласт, промегакариоцит и мегакариоцит. Количественно соотношение этих клеток выражается как 10:15:75 (в процентах от всей популяции). Процесс дифференцировки мегакариоцитарных элементов продолжается 25 ч (рис. 2).

В крови здоровых людей большинство циркулирующих тромбоцитов имеют характерную дисковидную форму, диаметр 2-4 мкм, толщину до 1,0 мкм и средний объем 6-9 мкм³.

При этом 2/3 тромбоцитов циркулируют в крови, около 1/3 находится в селезенке. Средняя продолжительность жизни тромбоцитов составляет 10 сут. Количество тромбоцитов в норме – 180-350х10⁹/л.

Поверхностная мембрана тромбоцита имеет сложную структуру. Ее наружный слой – гликокаликс, богатый гликопротеинами. В пространствах многослойной мембраны расположены микротрубочки, формирующие цитоскелет тромбоцита. Кроме плотной микротубулярной системы цитоскелет тромбоцитов образуют нити актина, спектрина и других протеинов, связанные с мембраной и пронизывающие тромбоцит во всех направлениях. В цитоплазме тромбоцитов расположены митохондрии, гликоген, лизосомы, пероксисомы и гранулы, содержащие различные вещества.

В тромбоцитах выделяют 3 вида органелл хранения: α-гранулы, плотные гранулы (δ-гранулы) и лизосомы (γ-гранулы). В α-гранулах содержится около 30 различных белков, большинство из которых были синтезированы еще в мегакариоцитах. В плотных гранулах (δ-гранулы) накапливаются субстанции, вызывающие сосудистые реакции и агрегацию тромбоцитов. Лизосомы (γ-гранулы) включают гидролазы – пероксидазу, тромбоцитарную гепариназу, галактозидазу, эндогликозидазу, кислую фосфатазу и др. (рис. 3).

Участие тромбоцитов в гемостазе требует активного взаимодействия с другими клетками, плазменными белками и небелковыми вществами. Роль посредника между тромбоцитом и различными факторами внешней среды, в том числе компонентами процесса гемостаза, играют рецепторы тромбоцитов. На мембране тромбоцитов человека выявлено около 30 участков рецепторного связывания биологически активных соединений разнообразной химической природы.

Тромбоциты играют ведущую роль в запуске процесса образования тромба. Активация тромбоцитов в циркулирующей крови приводит к изменению их формы из дисковидной в сферообразную (активированные клетки с повышенной способностью к адгезии, образованию агрегатов и секреции биологически активных соединений, которые непосредственно участвуют или влияют на гемостаз). Исследование способности тромбоцитов к активации, их структурных и функциональных изменений является важной задачей. Понимание механизмов, лежащих в их основе, расширяет возможности профилактики и коррекции нарушений в системе гемостаза, не только отягощающих течение заболевания, но нередко определяющих его исход.

Активация тромбоцитов обычно начинается в результате воздействия на плазматическую мембрану многообразных внешних стимулов и представляет собой процесс быстрого перехода из интактного в активированное состояние. Таким стимулирующим эффектом обладают нуклеотиды (АДФ), амины (адреналин, серотонин и др.), белки (тромбин, коллаген), арахидоновая кислота и ее производные (тромбоксан А2, простагландины), липиды (фактор активации тромбоцитов) и другие соединения. Большинство из них действуют как лиганды, специфически связываясь с поверхностно ориентированными белковыми структурами плазматической мембраны. В основе отдельных этапов активации лежат такие процессы, как структурно-функциональная перестройка мембраны, мобилизация и движение ионов, гидролиз фосфоинозитидов, высвобождение и окисление арахидоновой кислоты, фосфорилирование белков, повышение энергетического метаболизма, сокращение белков цитоскелета, изменение метаболизма циклических нуклеотидов. Именно благодаря способности тромбоцитов к активации реализуется их функциональное предназначение в организме.

Методы исследования функций тромбоцитов

В настоящее время в мировой практике широко используются следующие методы исследования функций тромбоцитов (табл. 2).

Время кровотечения

Время кровотечения (ВК) впервые было описано Дьюке в 1910 г. и относится к старейшим методам исследования первичного звена гемостаза. Данный тест до начала 1990-х гг. рассматривался как наиболее перспективный для изучения функции тромбоцитов.

ВК – это время от момента нанесения стандартной раны на кожу до момента прекращения вытекания крови.

ВК характеризует функциональную активность тромбоцитов и их взаимодействие с сосудистой стенкой. Этот скрининговый метод позволяет заподозрить тромбоцитопатии различного генеза, болезнь Виллебранда и нарушение проагрегантных свойств сосудистой стенки.

Недостатки оценки ВК:

• метод плохо стандартизуется;
• результаты теста позволяют лишь предположить наличие тех или иных нарушений;
• низкая чувствительность (отсутствие удлинения времени кровотечения не всегда позволяет исключить нарушения функции тромбоцитов или сосудистого звена гемостаза);
• низкая специфичность, не позволяющая однозначно интерпретировать результаты метода;
• не соответствует современным санитарно-эпидемиологическим требованиям;
• ВК может быть не связано с системой гемостаза и зависит от индивидуальных параметров (возраст, пол, гематокрит, толщина и температура кожи).

По этим причинам Британский комитет по стандартам в гематологии (British Committee for Standards in Haematology) не рекомендует использовать данный тест для исследования функциональной активности тромбоцитов.

Cветовая трансмиссионная агрегометрия

На смену методу определения ВК пришла методика под названием «агрегометрия», которая позволяет оценивать агрегационную способность тромбоцитов in vitro. В основе метода лежит возможность под действием специальных индукторов экспрессировать на своей поверхности специфические рецепторы, приводящие к образованию клеточных агрегатов.

Классическая световая трансмиссионная агрегометрия (LTA – light-transmission aggregometry), предложенная Густавом фон Борном в 1962 г., по-прежнему рассматривается многими исследователями как золотой стандарт для анализа функции тромбоцитов.

На рынке медицинской техники представлено большое количество различных агрегометров, однако вследствие использования разных протоколов и индукторов агрегации есть трудности в согласовании получаемых результатов. Стандартизированного параметра, по которому можно было бы однозначно судить о гиперактивности тромбоцитов и степени ее изменения на фоне приема антиагрегантных препаратов, в настоящее время не существует.

Принцип метода LTA состоит в том, что в обогащенную тромбоцитами плазму добавляют индуктор агрегации. Если происходит агрегация тромбоцитов, степень прохождения света через плазму возрастает, т. к. образуются тромбоцитарные агрегаты.

Индукторы агрегации условно можно разделить на 2 группы:

1. Слабые индукторы (АДФ в низких концентрациях, адреналин, вазопрессин, серотонин).
2. Сильные индукторы (коллаген, тромбин, высокие дозы АДФ, тромбоксан А2, фактор активации тромбоцитов).

Тромбоцитарный ответ условно разделяют на 3 типа.

1. Обратимый ответ, включающий первые три стадии активации. Он реализуется при действии слабых агонистов. В этом случае полная активация не обеспечивается, тромбоцитарный агрегат распадается, тромбоциты могут вернуться в свое первоначальное дисковидное состояние.
2. Необратимая агрегация тромбоцитов наблюдается при действии сильных агонистов, при этом происходит выброс содержимого α-гранул и плотных гранул.
3. Реакция дезагрегации, индуцируемая антагонистами.

Пример типичных агрегационных кривых, полученных с помощью разных индукторов агрегации, приведен на рисунке 4.

Проведение анализа на агрегометрах. Следует учитывать, что у агрегометров разный принцип работы, поэтому получаемые агрегатограммы отличаются, а число определяемых параметров агрегации неодинаково.

Интерпретация. Агрегация тромбоцитов – двухступенчатый процесс. Первичная волна агрегации – склеивание тромбоцитов в присутствии внешних агонистов, таких как АДФ, адреналин или ристоцетин.

Вторичная агрегация происходит после стимуляции тромбоцитов веществами, содержащимися в их органеллах (рис. 5).

Необходимо отметить, что одни агонисты стимулируют первичную волну агрегации, другие – вторичную. Кроме того, различные концентрации агониста могут давать первичную и вторичную волны агрегации. Например, высокие концентрации АДФ (10 мкг/мл в конечной концентрации) индуцируют одну широкую волну агрегации. Низкие концентрации АДФ вызывают двухфазную агрегацию (т. е. первичную и вторичную волну агрегации), а очень низкие концентрации АДФ (1,5 мкг/мл в конечной концентрации) вызывают первичную волну с последующей дезагрегацией. Двухфазный ответ на АДФ не будет наблюдаться у пациентов с нарушенными функциями тромбоцитов. У пациентов с тромбастенией Гланцмана не наблюдается агрегации независимо от концентрации АДФ. У пациентов с тяжелой болезнью Виллебранда агрегация с ристоцетином отсутствует. Коррекцию нарушенной агрегации ристоцетином можно наблюдать при добавлении нормальной, обогащенной тромбоцитами плазмы. Патологическая агрегация с ристоцетином наблюдается у пациентов с синдромом Бернара-Сулье, идиопатической тромбоцитопенической пурпурой, дефектами тромбоцитов (рис. 6).

Недостатками данного вида агрегометрии являются необходимость лабораторного оборудования и специально обученного медицинского персонала, трудоемкость и длительность исследования, высокая стоимость, что ограничивает рутинное его использование в клинической практике.

Продолжение следует.