Віруліцидна ефективність льодяників із фіксованою комбінацією цетилпіридинію хлориду та бензидаміну гідрохлориду проти вірусу грипу А

17.10.2022

Стаття у форматі PDF

На тлі епідемії коронавірусної інфекції SARS-CoV-2 актуальними стали пошуки ефективних методів лікування та запобігання інфекції. Препаратами, що, з-поміж інших, привернули до себе увагу, стали пероральні антисептики – завдяки своїй здатності до зниження вірусного навантаження в ротовій порожнині та зменшення ризику передачі інфекції. До таких антисептиків належить, зокрема, цетилпіридинію хлорид (ЦПХ), наявні наукові дані щодо якого демонструють найбільш обнадійливі результати з огляду на його широкий спектр антибактеріальної та противірусної дії [1]. За результатами деяких клінічних досліджень, ополіскувачі для ротової порожнини, що містять ЦПХ, здатні знижувати вірусне навантаження SARS-CoV-2, що вказує на потенційні можливості цієї активної речовини в боротьбі з COVID-2019 [2, 3]. ЦПХ як самостійна активна речовина або в комбінації з іншими активними речовинами зазвичай міститься в засобах для місцевого перорального застосування у формі рідини для полоскання ротової порожнини, льодяників і спреїв.

Респіраторні вірусні інфекції є одними з найпоширеніших захворювань у світі. За­звичай вони проявляються у вигляді таких симптомів, як біль у горлі, кашель, підвищення температури тіла, запалення слизової оболонки носа. Хоча в більшості випадків вірусні інфекції зникають самостійно і не потребують особливого лікування, хворі часто вдаються до самолікування різними препаратами, що полегшують симптоми або усувають причину інфекції [4]. Льодяники з фіксованою комбінацією бензидаміну гідрохлориду (БГ) та ЦПХ мають клінічну ефективність в усуненні симптомів болю в горлі [5]. Резуль­тати нещодавнього дослідження in vitro також підтвердили їхню віруліцидну дію на вірус SARS-CoV-2 [6]. Віру­лі­цидна ефективність ЦПХ доведена також проти різних штамів вірусу грипу, оскільки дослідження in vitro підтвердили руйну­вання вірусної оболонки під впливом цієї активної речовини [7]. Мета дослідження, проведе­ного нами в ­Інституті ­мікробіології та імуно­логії медич­ного факультету в умовах in vitro, – підтвер­дити віруліцидну дію льодяників із фіксованою комбіна­цією ­БГ/ЦПХ на вірус грипу A та одночасно ­по­рівняти ­віруліцидну дію ЦПХ та комбінації ­БГ/ЦПХ у ­вигляді вільних активних речовин. Метою було також оцінити потенційний вплив на віруліцидну ефективність інших активних речовин (БГ) і допоміжних речовин у складі льодяника.

Методи

Дослідження проводилося відповідно до методів і вимог, встановлених стандартом Сло­венського інституту стандартизації до оцінки віруліцидної активності лікарських засобів для застосування людиною [8]. Умови дослідження та тривалість експозиції були обрані та пристосовані до фізико-­хімічних властивостей ротової порожнини у ­людини з урахуванням таких чинників, як температура, склад (біологічне навантаження) і ­кількість слини, що виділяється в процесі розчинення льодяника, а також динаміки розчинення льодяників (за різної тривалості експозиції).

Виділення та кількісний аналіз вірусу

Досліджуваний ортоміксовірус, тобто вірус грипу А, штам A/Victoria/3/75, підтип гемаглютинін 3, нейрамінідаза 2 (H3N2), був отриманий з Американської колекції типових культур (American Type Culture Collection, ATCC). Попередньо було здійснено розмноження на культурі клітин й визначено кількість ­вірусу. Використовувалася клітинна лінія MDCK – собача нирка ­Мадін-Дарбі (Madin-Darby canine kid­ney, MDCK) і найменше основне живильне середовище з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки (fetal bovine serum, FВS) і трипсину з бичачої підшлункової залози (trypsin from bovinepancreas, TPCK) у кінцевій концентрації трип­сину 2 мкг/мл. Концентра­цію вірусного ізоляту визначали методом Спірмена – Кербера [9]. Для кожного штаму вірусу визначено розведення вірусу (виражене в одиницях вірусу на 1 мл), за якого вірус інфікує 50% клітин у куль­турі – медіанна інфікуюча доза для культури ­тканини (median tissue culture infectious dose, TCID50/мл). Вихідна концентрація розмноже­но­го вірусу становила 109,41 TCID50/мл (табл. 1).

Випробування на віруліцидність та контрольні процедури

Досліджувані субстанції розчиняли у жорсткій воді з додаванням «інтерферувальної речовини» (далі – суспензія) з метою створення умов із біологічним навантаженням, що імітує склад слини. Суспензією був розчин бичачого сироваткового альбуміну (bovine serum albumin, BSA) 3,0 г/л води з еритро­цитами в концентрації 3,0 мл/л. Культури ­вірусу під­давали дії досліджуваних субстанцій за температури 37 °C протягом 1, 5 та 15 хв, що відповідає середньому часу розсмоктування льодяників (5-10 хв). Засто­со­ву­вали 3 концентрації досліджуваних субстанцій, отримані шляхом розчинення досліджуваної субстанції в 4 (висока), 20 (середня) та 30 мл (низька концентрація) суспензії. Досліджувані субстанції представлені в таблиці 2.

Окрім досліджень з метою оцінки віруліцидної дії кожної досліджуваної субстанції, проводилися також відповідні контрольні процедури: контроль клітин і вірусу, контроль вірусу протягом усього періоду інкубації, пригнічення активності досліджуваної субстанції в крижаному клітинному середовищі, вплив досліджуваної субстанції на чутливість клітини до вірусу та її цитотоксичний ефект на клітини.

Результати контрольних процедур

В умовах дослідження вірус залишався стабільним протягом усього періоду дослідження, значного зниження концентрації інфекційних вірусних частинок не спостерігалося. Було продемонстровано інгібуючий вплив крижаного середовища на дію досліджуваної субстанції у високій концентрації (досліджувана субстанція, розведена в 4 мл середовища). Титр вірусу до і після експозиції істотно не відрізнявся і не перевищував різницю в 1-log10 (c) від значення концентрації, встановленого як граничне значення згідно зі стан­дартними рекомендаціями.

Жодна з досліджуваних субстанцій у найвищій нецитотоксичній концентрації не вплинула на чутливість клітин до вірусу. Спостері­галися лише дуже незначні, але прийнятні відхилення.

Цитотоксичність досліджуваних субстанцій у високій концентрації перевіряли в роз­веденнях від 10-1 до 10-11. Цитотоксичність з деформацією або руйнуванням клітинного шару досліджуваних субстанцій ЦПХ, комбінації БГ і ЦПХ у вигляді вільних активних речовин, льодяників із БГ і ЦПХ зі смаком евкаліпта та льодяників плацебо зі смаком евкаліпта виявили в розведеннях 10-1 та 10-2. Проте для льодяників зі смаком лимона та меду з БГ і ЦПХ та льодяників плацебо зі смаком лимона та меду цитотоксичність виявили лише в розведенні 10-1. З огляду на це визначили межу для встановлення цитопатичного ефекту вірусу. Рівень цитотоксичності відносно розведення вірусу в досліджуваній суспензії наведено в таблиці 4.

Результати ефективності досліджуваних субстанцій на інактивацію вірусу

Вірус піддавався впливу кожної концентрації шляхом проведення двох аналізів у різні дні. Кінцевий результат відображено як середнє значення результатів обох аналізів. Результати експозиції в числовій формі представлені в таблицях 3 та 4, а в графічній – на рисунках 1-3.

 

Рис. 1. Експозиція вірусу грипу А в досліджуваній  субстанції в найвищій концентрації  (еквівалент розчинення одного льодяника у 4 мл суспензії) у трьох різних значеннях часу експозиції

Рис. 1. Експозиція вірусу грипу А в досліджуваній субстанції в найвищій концентрації (еквівалент розчинення одного льодяника у 4 мл суспензії) у трьох різних значеннях часу експозиції

Примітки: TCID50/мл – 50%-ва доза, що інфікує культуру тканини, ЛЕ – льодяник, евкаліпт, ЛЛМ – льодяник, лимон, мед.

Рис. 2. Експозиція вірусу грипу А в досліджуваній  субстанції в середній концентрації 

Рис. 2. Експозиція вірусу грипу А в досліджуваній субстанції в середній концентрації (еквівалент розчинення одного льодяника в 20 мл суспензії) у трьох різних значеннях часу експозиції

Примітки: TCID50/мл – 50%-ва доза, що інфікує культуру тканини, ЛЕ – льодяник, евкаліпт, ЛЛМ – льодяник, лимон, мед.

Рис. 3. Порівняння зниження кількості  інфекційних вірусів у найвищій концентрації  (еквівалент розчинення одного льодяника у 4 мл суспензії) у трьох різних значеннях часу експозиції

Рис. 3. Порівняння зниження кількості інфекційних вірусів у найвищій концентрації (еквівалент розчинення одного льодяника у 4 мл суспензії) у трьох різних значеннях часу експозиції

Примітки: TCID50/мл – 50%-ва доза, що інфікує культуру тканини, ЛЕ – льодяник, евкаліпт, ЛЛМ – льодяник, лимон, мед.

Віруліцидна дія була сильно вираженою при найвищій концентрації, що еквівалентно розчиненню одного льодяника в 4 мл суспензії. При середній концентрації, що еквівалентно розчиненню одного льодяника в 20 мл суспензії, віруліцидна дія була вираженою, але зі зміненою динамікою, оскільки подібні ефекти спостерігалися лише через 15 хв.

Результати демонструють помітну різницю між віруліцидною дією льодяників, що містять активні речовини, та льодяників плацебо. Така різниця є найбільш помітною при високих і середніх концентраціях, але також спостерігається і при низьких концентраціях.

Обговорення

Віруліцидна дія ЦПХ на вірус грипу вже була досліджена й підтверджена раніше в деяких інших дослідженнях [7]. Проведене нещодавно дослідження in vitro продемонструвало віру­ліцидну дію на вірус SARS-CoV-2 льодяників із комбінацією БГ та ЦПХ. Концен­трація вірусу в суспензії з найвищою концентрацією вже за хвилину знизилася на 4 log10 (c) [6].

Це дослідження, як очікувалося, продемонструвало подібні тенденції віруліцидної активності льодяників із комбінацією БГ та ЦПХ щодо вірусу грипу А, оскільки в обох випадках використані in vitro віруси з оболонкою, на які, як передбачається, ЦПХ має пряму дію [6, 7]. Дослідження проводилося за однаковим протоколом і за таких же умов, як і дослідження з вірусом SARS-CoV-2.

Істотною відмінністю був лише трипсин у підтримувальному середовищі, додавання якого потрібно для забезпечення інфекційно­сті вірусу грипу. У зв’язку з надзвичайно низькою концентрацією трипсину в живильному середовищі його дію на досліджувану субстанцію не перевіряли, оскільки початкова інкубація вірусу з активною речовиною була без цієї добавки. Трипсин додавали лише в те середовище, в якому були приготовані розведення досліджуваної субстанції з вірусом, перед нанесенням на культури клітин.

Найвища віруліцидна дія усіх досліджуваних субстанцій, як очікувалося, спостерігалася в суспензії з високою концентрацією, де було доведено, що концентрація інфекційних вірусів вже через 5 хв знижується більше ніж на 4 log10 (c) (зниження у 10 000 разів, або на 99,99 %). Льодяники з комбінацією БГ і ЦПХ (зі смаком евкаліпта, лимона та меду) досягли зниження на 4 log10 (c) вже через 1 хв (рис. 1, 3). Зважаючи на всі контрольні процедури, результати свідчать про високу віруліцидну ефективність досліджуваних субстанцій. Віруліцидна дія льодяників плацебо (зі смаком евкаліпта, лимона та меду) значно нижча за дію льодяників із комбінацією БГ та ЦПХ, як показано на рисунках 1, 3 та в таблиці. 4. Льодяники з комбінацією БГ і ЦПХ досягли відповідного зниження концентрації інфекційних вірусів на 4 log10 (c) також у суспензії із середньою концентрацією. Враховуючи всі параметри динаміки розчинення льодяника та слиновиділення (приблизно від 4,0 до 5,0 мл/хв при стимуляції, наприклад, розсмоктуванні льодяника), вони найбільше наблизилися до передбачуваної концентрації, яка могла б бути досягнута при фактичному вживанні льодяника, припускаючи, що на його розчинення потрібно 5-10 хв [10]. ЦПХ і комбінація БГ/ЦПХ у вигляді вільних активних речовин також наблизилися до межі зниження на 4 log10 (c).

Як і в попередньому дослідженні in vitro із SARS-CoV-2, так і в дослідженні штаму вірусу грипу досліджувані субстанції в низьких концентраціях не продемонстрували зниження на 4 log10 (c) навіть через 15 хв [6]. Чітка тенденція до зниження кількості вірусу спостерігалася протягом 15 хв контакту із суспензіями досліджуваних субстанцій при всіх концентраціях (за винятком льодяників плацебо).

Як льодяники з комбінацією БГ та ЦПХ, так і БГ та ЦПХ у вигляді вільних активних речовин продемонстрували чітку динаміку віруліцидної активності – найшвидше ефекти виявлялися при найвищій концентрації, а швидкість дії знижувалася зі зменшенням концентрації. Крива зниження концентрації вірусів із часом ставала все більш пласкою при середній, а ще більше – за найнижчої концентрації (рис. 1, 2). Така динаміка не спостерігалася з льодяниками плацебо (з обома смаками), щодо яких через 15 хв спостерігався постійний ефект зниження концентрації інфекційних вірусів від 1,94 до 2,82 log10 (c). Як було встановлено під час досліджень in vitro з вірусом ­SARS-CoV-2, чинником ­інактивації вірусів, ймовірно, є також низьке значення рН, аналогічне до значення у льодяників із комбінацією БГ і ЦПХ [6].

Однією з найважливіших властивостей, які повинен мати пероральний антисептик, є стійкість у місці нанесення. Відомо, що стійкість ЦПХ висока (від 3 до 5 год), завдяки чому його ефективність проти вірусу може бути більш високою та тривалішою [1]. 

Крім того, досягненню вищої ефективності може сприяти також лікарська форма. Лікар­ськими формами для місцевого полегшення болю в горлі є ополіскувачі для ротової порожнини, спреї та льодяники. Було доведено, що після застосування ­льодяників активна речовина затримується в ротовій порожнині більшою мірою і змивається повільніше, ніж при застосуванні спреїв і ополіскувачів для ротової порожнини. Це свідчить про те, що ефект льодяників може бути тривалішим [11].

Результати досліджень ґрунтуються на контрольованих лабораторних умовах, що імітують фізіологічні умови в ротовій порожнині.

Через низку факторів результати дослідження in vitro не можна перенести до умов in vivo, навіть якщо взяти до уваги фізико-хімічні умови, до яких ми намагалися наблизитися. Дослід­ження лише продемонструвало, що ЦПХ, комбінація БГ та ЦПХ у вигляді вільних активних речовин, як і комбінація БГ та ЦПХ у льодяниках, мають віруліцидну дію і з однаковою ймовірністю могли б діяти на слизові оболонки рота та глотки. У будь-якому випадку віруліцидна дія була б обмежена вільними інфекційними вірусами в слизовій оболонці або слині, які піддавалися б безпосередньому впливу активної речовини. За даними літератури, концентрація вірусних частинок у слині знаходиться в діапазоні від 4 до 6 log10 (с) копій геному на 1 мл [12]. У цьому дослідженні концентрація вірусу була набагато більшою (8-10 log10 (c) інфекційних вірусних частинок на 1 мл). Подальші дослідження мали б сенс у контексті клінічних випробувань. Якби результати показали аналогічну ефективність, застосування льодяників із комбінацією БГ та ЦПХ могло б значною мірою вплинути на зниження ймовірності передачі вірусу повітряно-краплинним шляхом.

Дослідження in vitro підтвердило віруліцидну активність ЦПХ та комбінації БГ і ЦПХ у вигляді вільної активної речовини та у формі льодяників щодо вірусу грипу А.

Найбільшу ефективність, що суттєво відрізнялася від ефективності льодяників плацебо, продемонстрували льодяники з комбі­нацією БГ та ЦПХ; вона була зіставною з ефективністю льодяників зі смаком евкаліпта та льодяників зі смаком лимона та меду.

Список літератури знаходиться в редакції.

Steyer A. et al. Virucidal Efficacy of Lozenges with a Fixed-Dose Combination of Cetylpyridinium Chloride and Benzydamine Hydrochloride Against Influenza A Virus. Med Razgl. 2022; 61 (1): 121-30.

Тематичний номер «Педіатрія»№ 3 (64)-4 (65) 2022 р.

СТАТТІ ЗА ТЕМОЮ Пульмонологія та оториноларингологія

25.11.2022 Пульмонологія та оториноларингологія Терапія та сімейна медицина Багатоцентрове рандомізоване відкрите порівняльне дослідження ефективності назального спрея Аква Маріс® Екстра Стронг як симптоматичної терапії за відкладеного призначення антибіотиків у лікуванні гострого риносинуситу в дітей 6-11 років

Гострий риносинусит (ГРС) – найчастіша респіраторна інфекція. Поняття «риносинусит» (РС) почало широко використовуватися з 2005 року, оскільки було доведено, що запальний процес розвивається одночасно в порожнині носа та приносових пазухах [1]. У подальшому було проведено велику кількість присвячених ГРС досліджень, результати яких узагальнено в EPOS 2020 – європейському погоджувальному документі щодо діагностики й лікування гострого та хронічного риносинуситу і назальних поліпів [2]. Відповідно до сучасних поглядів, поняття ГРС включає три нозологічні форми: гострий вірусний РС, поствірусний РС і бактеріальний РС. ...

22.11.2022 Алергія та імунологія Пульмонологія та оториноларингологія Терапія та сімейна медицина Алергія як форма запалення

Згадаймо, що таке запалення. Це комплексний місцевий і загальний захисно-пристосувальний процес, що виникає у відповідь на пошкодження або дію патогенного подразника та проявляється в реакціях, спрямованих на усунення продуктів, а якщо можливо, то й агентів, і забезпечує максимальне відновлення в зоні ушкодження. Механізм запалення є спільним і для людини, і для тварин (зокрема нижчих), незалежно від локалізації, виду подразника та індивідуальних особливостей організму [1]. ...

25.10.2022 Педіатрія Пульмонологія та оториноларингологія Раціональне застосування мукоактивних препаратів для лікування захворювань дихальних шляхів у дітей

Гострі респіраторні захворювання (ГРІ) є найпоширенішим типом захворювань у дітей, їх частка складає близько 90% усієї інфекційної патології дитячого віку [1]. Щороку ГРІ накладають величезний тягар як на систему охорони здоров’я, що пов’язано з частими зверненнями по медичну допомогу, госпіталізацією та призначенням антибактеріальних препаратів, так і на суспільство в цілому. Останній факт пов’язаний із частим невиходом одного з батьків на роботу та втратою продуктивності [1, 2]....

25.10.2022 Педіатрія Пульмонологія та оториноларингологія Застосування та оцінка променевих і акустичних методів для діагностики у дітей пневмонії, в тому числі викликаної вірусом SARS-CoV-2

Пневмонія може супроводжуватися тяжкими ускладненнями і мати небезпечні для життя наслідки (F.M. Benedictis, C.M. Nascimento-Carvalho, 2020). В етіології цієї патології все більшого значення набувають віруси, що спричинюють «нетипову» картину захворювання. При COVID-19 пневмонія є загрозливим проявом. Вірус SARS-CoV-2 постійно мутує і, відповідно, викликає більш тяжку за перебігом пневмонію. Тому своєчасна діагностика цього загрозливого стану набуває великого практичного значення. Вона достатньо складна і потребує комплексного дослідження з урахуванням як клінічних симптомів, так і результатів параклінічних методів дослідження....