5 серпня, 2024
Інгібування ксантиноксидоредуктази зменшує ушкодження ендотелію клубочків, спричинене глюкозою, за допомогою активації шляху реутилізації пуринів AMФK
Діабетична хвороба нирок (ДХН; діабетична нефропатія) – основне віддалене тяжке мікросудинне ускладнення цукрового діабету (ЦД), що є провідною причиною розвитку термінальної стадії ниркової недостатності [1]. Тривалий вплив гіперглікемії стимулює надмірне продукування в нирках активних форм кисню (АФК), які можуть бути причиною розвитку і прогресування ДХН. Окрім гіперглікемії у патогенезі захворювання задіяні багатофакторні патофізіологічні порушення, зокрема медіатори, що впливають на гемодинаміку, метаболічні відхилення, запалення та фіброз [2]. Хоча молекулярні механізми, які лежать в основі ДХН, є складними і не повністю з’ясованими, відомо, що ключову роль у розвитку та прогресуванні ДХН відіграє дисбаланс між утворенням АФК і механізмами антиоксидантного захисту [3]. Окислювальний стрес, спричинений надмірним утворенням АФК у результаті декількох ендогенних шляхів, і потенційна взаємодія між джерелами АФК можуть призводити до ендотеліальної дисфункції, спричиненої ушкодженням клітин ендотелію клубочків (КЕК), що, як припускають, має місце на ранніх етапах патогенезу ДХН [4].
Сечова кислота є кінцевим продуктом окислення в процесі метаболічного розщеплення пуринових нуклеотидів [5]. Ксантиноксидоредуктаза (КОР), у тому числі ксантиндегідрогеназа (КДГ) і ксантиноксидаза (КО), регулює ключовий процес, що обмежує швидкість розпаду аденозинтрифосфату (АТФ) і пуринів. Від активності цих ферментів залежить окисне гідроксилювання гіпоксантину/ксантину до ксантину / сечової кислоти, що призводить до утворення АФК [6]. Високий вміст глюкози (ВВГ) може індукувати утворення у КЕК КОР-похідних АФК і призводити до порушення проникності ендотелію клубочків і гомеостазу в нирках [7, 8]. Попередні дослідження показали, що КОР-похідні АФК можуть сприяти патогенезу ДХН у результаті посилення оксидативного стресу та запальної відповіді внаслідок активації шляху ядерного фактора-κB (NF-κB) [9]. Також, за даними клінічних досліджень, припускають значущий зв’язок між підвищеною активністю КОР і поганим глікемічним контролем [10, 11]. Крім того, висока активність КОР корелює з дисфункцією ендотелію судин у пацієнтів із ЦД [12]. Таким чином, інгібування КОР для профілактики ДХН шляхом зменшення продукування АФК і вираженості оксидативного стресу може виявитися перспективнішим, аніж лише контроль рівня сечової кислоти.
Активована аденозинмонофосфатом (АМФ) протеїнкіназа (АМФК) є ключовим регулятором клітинного метаболізму, який бере участь в активації шляхів утворення енергії, одночасно інгібуючи шляхи споживання енергії у відповідь на клітинний стрес [13, 14]. Дані проведеного раніше дослідження продемонстрували, що інгібування КОР запобігає гострому контраст-індукованому ураженню нирок завдяки зменшенню оксидативного стресу в результаті активації AMФK та її низхідного сигнального шляху [15]. Однак у цьому дослідженні не було виявлено точного механізму активації AMФK у результаті інгібування КОР. Це дослідження мало на меті з’ясувати цитопротекторні ефекти інгібування КОР при ушкодженні КЕК і точний механізм активації AMФK, пов’язаний зі шляхом реутилізації пуринів у результаті інгібування КОР, за допомогою in vitro моделі ДХН із використанням КЕК людини, що перебував у середовищі з високим умістом глюкози. Крім того, ще однією метою дослідження стало з’ясувати, чи має переваги фебуксостат, потужний селективний інгібітор КОР, у зменшенні ушкодження КЕК за допомогою згаданого нового механізму, та оцінити потенціал його використання як засобу для запобігання ушкодженню КЕК при ДХН.
Методи
КЕК культивували протягом 48 год у середовищі з нормальним вмістом глюкози (низький вміст глюкози (НВГ) – 5,6 ммоль/л глюкози + 27,5 ммоль/л маніту) або ВВГ (33 ммоль/л глюкози). КЕК були розділені на 4 групи: група НВГ; група НВГ, яка отримувала фебуксостат (НВГ+ Feb); група ВВГ і група ВВГ, яка отримувала фебуксостат (ВВГ + Feb). Доза фебуксостату була визначена на основі результатів попереднього дослідження і становила 0,25 мкМ (доза, яка підвищує життєздатність КЕК у середовищі з ВВГ і активує AMФK) [15].
Життєздатність клітин оцінювали після 48 год інкубування в середовищі з НВГ або ВВГ і з додаванням фебуксостату за допомогою МТТ-аналізу (3-[4,5-диметил(тіазол‑2-іл)-3,5-диферил] тетрадію броміду). Щоб проаналізувати зміни активності AMФK та її низхідного сигнального шляху після впливу фебуксостату на КЕК у середовищі з ВВГ, було застосовано метод імуноблоту. Перекисне окислення ліпідів малонового діальдегіду (MДA) оцінювали за допомогою набору для аналізу OxiSelect TBARS згідно з протоколами виробника. Утворення АФК в клітині вимірювали за допомогою нефлуоресцентної сполуки, що проникає в клітини, 2'-7'-діхлорофлуоресцеїну діацетату (DCF-DA) (Thermo Fisher Scientific).
Рівні КОР визначали двічі за допомогою набору для імуноферментного аналізу XDH/XO (Lifespan Biosciences). Активність супероксиддисмутази (СОД) оцінювали за допомогою набору для визначення активності СОД (Abnova, Taipei City, Taiwan) відповідно до інструкції виробника.
Для кожного аналізу було проведено щонайменше 3 незалежні вимірювання, а результати були подані як середнє ± стандартне відхилення. Статистичну значущість між групами оцінювали за допомогою дисперсійного аналізу, за яким слідував критерій множинних порівнянь Тьюкі (SPSS версія 20.0, IBM Corp., Армонк, Нью-Йорк, США). Статистично значущим вважали p<0,05.
Результати
Інгібування КОР достовірно збільшує виживаність КЕК у середовищі з ВВГ
Спочатку людські КЕК обробляли 0,1; 1 або 10 мкМ фебуксостату протягом 48 год в умовах нормоглікемії (НВГ) і в ВВГ, щоб визначити належну концентрацію фебуксостату для захисту клітин у середовищі з ВВГ. Порівняно з контрольною групою (НВГ) життєздатність клітин у групі ВВГ знизилася на 60%. Обробка фебуксостатом не впливала на виживання клітин в умовах НВГ, тоді як у середовищі з ВВГ виживання клітин після обробки фебуксостатом дозозалежно збільшувалося. Життєздатність КЕК у середовищі з ВВГ після обробки фебуксостатом достовірно зростала, коли концентрація препарату перевищувала 0,1 мкМ (p<0,01).
Інгібування КОР впливає на шлях реутилізації пуринів і збільшує співвідношення АМФ/АТФ у КЕК в середовищі з ВВГ
З метою дослідження механізму, за допомогою якого інгібування КОР активує AMФK, оцінювали зміни рівнів КОР і співвідношення внутрішньоклітинного АТФ до АМФ, зумовлені впливом фебуксостату на КЕК в умовах ВВГ. Рівні КОР не змінювалися в умовах НВГ, але підвищувалися в середовищі з ВВГ (p<0,001). Як і очікувалося, фебуксостат достовірно зменшував рівні КОР у КЕК в умовах ВВГ (p<0,001). Рівні ксантину/гіпоксантину в КЕК статистично значуще підвищувалися в умовах ВВГ, а обробка фебуксостатом достовірно їх знижувала (p<0,05).
КОР каталізує останні два етапи гідроксилювання в процесі розщеплення пуринів, активуючи шлях реутилизації пуринових основ з утворенням пуринових нуклеотидів [17, 28]. ВВГ підвищував внутрішньоклітинні концентрації АМФ і АТФ і знижував внутрішньоклітинне співвідношення АМФ/АТФ, а опосередковане фебуксостатом інгібування КОР додатково збільшувало внутрішньоклітинну концентрацію АМФ у КЕК в умовах ВВГ. Співвідношення внутрішньоклітинного АМФ/АТФ у разі обробки фебуксостатом зростало як у КЕК, які були поміщені в середовище з НВГ, так і в умовах ВВГ (p<0,001).
Інгібування КОР збільшує фосфорилювання AMФK і активує її низхідний сигнальний шлях у КЕК в умовах ВВГ
Потім оцінювали вплив інгібування КОР на ушкодження КЕК, спричинене ВВГ, через активацію AMФK та її низхідного шляху в КЕК в умовах ВВГ. Тоді як ВВГ достовірно знижував співвідношення фосфо-Thr172 / загальної АМФК, обробка фебуксостатом ефективно відновлювала фосфорилювання АМФК у КЕК при ВВГ (p<0,01). ВВГ також пригнічував експресію PGC‑1α і PPAR-α, але обробка фебуксостатом відновлювала експресію в КЕК в умовах ВВГ (p<0,001 і p<0,01 відповідно). Хоча серед експериментальних груп не було виявлено помітних відмінностей в експресії фосфо-Ser256 / загального FoxO1, експресія фосфо-Ser253 / загального FoxO3a підвищувалася в умовах ВВГ і достовірно знижувалася після впливу фебуксостату (p<0,05).
Інгібування КОР зменшує оксидативний стрес унаслідок інгібування НАДФН-оксидаз і посилення активності СОД у КЕК в умовах ВВГ
Окислювальний стрес у середовищі з ВВГ пов’язаний зі збільшенням активності НАДФН-оксидази та зниженням активності антиоксидантних ферментів при ДХН [16]. Активність Nox1, Nox2 і Nox4 у КЕК в умовах ВВГ стійко зростала і достовірно знижувалася після обробки фебуксостатом (p<0,001, p<0,05 і p<0,001 відповідно). Крім того, активність СОД була достовірно нижчою в КЕК в умовах ВВГ проти КЕК в умовах НВГ і обробка фебуксостатом достовірно підвищувала активність СОД у КЕК в умовах ВВГ (p<0,01). Рівень MДA, корисного біомаркера перекисного окислення ліпідів і оксидативного стресу, був помітно вищим в КЕК в умовах ВВГ порівняно з КЕК в умовах НВГ, і фебуксостат достовірно його знижував (p<0,05). Ці результати показують, що надто сильний оксидативний стрес, спричинений середовищем із ВВГ, був зумовлений інгібуванням КОР.
Інгібування КОР зменшує оксидативний стрес за допомогою AMФK-залежних сигналів шляхом реутилізації пуринів у КЕК в умовах ВВГ
Щоб дослідити, чи зумовлений вплив інгібування КОР на ушкодження КЕК в умовах ВВГ саме AMФK-залежними сигналами, були проведені подальші експерименти з виключенням AMФK з використанням малої інтерферуючої РНК (міРНК), спрямованої на AMФKα1 і AMФKα2 у КЕК в середовищі з НВГ або ВВГ. Незважаючи на застосування фебуксостату, фосфорилювання AMФK в умовах ВВГ у КЕК із трансфікованими міРНК, націленими на AMФKα1 і AMФKα2, залишалося стійко пригніченим порівняно з КЕК із трансфікованими контрольними міРНК (p<0,01). Це узгоджується зі змінами рівнів фосфо-Thr172 / загального рівня АМФК, коли експресія PGC‑1α в середовищі з ВВГ в КЕК із трансфікованими міРНК, націленими на AMФKα1 і AMФKα2, значно знижувалася порівняно з контрольною групою, незважаючи на обробку фебуксостатом (p<0,01). Навпаки, фосфорилювання FoxO3a в умовах ВВГ і за наявності міРНК, націлених на AMФKα1 і AMФKα2, додатково зростало порівняно з групою контролю, незважаючи на обробку фебуксостатом (p<0,05). ВВГ призводив до збільшення кількості DCF-DA-позитивних клітин, а обробка фебуксостатом помітно знижувала внутрішньоклітинні рівні АФК у КЕК у середовищі з ВВГ, при оцінці за DCF-DA. Антиоксидантні ефекти впливу фебуксостату на КЕК в умовах ВВГ були усунені після обробки міРНК, націленими на AMФKα1 і AMФKα2, (p<0,01).
Аби підтвердити, що активація AMФK внаслідок інгібування КОР пов’язана з HPRT1-залежним шляхом реутилізації пуринів, визначали зміни експресії AMФK і пов’язаного з нею низхідного сигнального шляху після обробки фебуксостатом КЕК із трансфікованими міРНК, націленими на HPRT1, в умовах ВВГ. Фосфорилювання AMФK і PGC‑1α у КЕК із трансфікованими міРНК, націленими на HPRT1, в умовах ВВГ було значно нижчим, ніж у контрольній групі, незалежно від обробки фебуксостатом (p<0,001 і p<0,001). З іншого боку, фосфорилювання FoxO3a було достовірно вищим у КЕК із трансфікованими міРНК, націленими на HPRT1, в умовах ВВГ, у порівнянні з групою з контрольними міРНК, незважаючи на обробку фебуксостатом (p<0,05).
Обговорення
Дослідження продемонструвало, що інгібування КОР чинить цитопротекторну дію при ушкодженні КЕК в умовах ВВГ шляхом активації AMФK за участю шляху реутилізації пуринів. При ушкодженні КЕК, зумовленому ВВГ, спостерігали підвищення рівнів КОР, що корелювало з пригніченням фосфорилювання AMФK. Ці зміни спричинювали інгібування PGC‑1α і PPAR-α, що згодом призводило до фосфорилювання FoxO3a та активації Noxs, тим самим посилюючи оксидативний стрес.
Застосування фебуксостату зменшувало ушкодження ендотеліальних клітин в умовах ВВГ шляхом активації фосфорилювання АМФК і збільшення внутрішньоклітинного співвідношення АМФ/АТФ. Це сприяло активації PGC‑1α, дефосфорилюванню FoxO3a та пригніченню Noxs, що зрештою забезпечувало усунення оксидативного стресу в нирках. Отримані результати свідчать про те, що інгібування КОР зменшує ушкодження КЕК в умовах оксидативного стресу, спричиненого ВВГ, унаслідок активації шляху AMPK-PGC‑1α-FoxO3a із залученням шляху реутилізації пуринів.
Кілька попередніх досліджень продемонстрували, що зниження концентрації пуринових метаболітів, таких як сечова кислота та КO, послаблює оксидативний стрес шляхом активації AMФK [15, 17-20]. Оксидативний стрес, індукований сечовою кислотою, стимулює резистентність до інсуліну, а активація АМФК завдяки застосуванню метформіну знижує індуковану сечовою кислотою резистентність до інсуліну в клітинах скелетних м’язів [18].
Kim та співавт. [19] також виявили, що використання фебуксостату зменшує стрес в ендоплазматичному ретикулумі завдяки активації АМФК в оброблених тунікаміцином проксимальних тубулярних клітинах і в мишачій моделі з односторонньою обструкцією сечоводу. Наше попереднє дослідження продемонструвало, що контраст-індукований окислювальний стрес достовірно погіршував функцію нирок і посилював активність КОР, тоді як фебуксостат полегшував гостре ушкодження нирок шляхом посилення фосфорилювання AMФK [15]. У проведеному зараз дослідженні оцінювали вплив інгібування КOР на AMФK-залежний сигнальний шлях при ушкодженні КЕК в умовах ВВГ. Захисну дію фебуксостату, спрямовану на внутрішньоклітинні АФК, індуковані ВВГ, послаблювали за допомогою міРНК, націлених на AMФK-α1/2. Це дослідження стало першим, що підтверджує корисну роль пригнічення КОР фебуксостатом через активацію AMФK при ушкодженні КЕК, пов’язаному з оксидативним стресом в умовах ВВГ.
АМФК є головним регулятором енергетичного гомеостазу клітини, відновлює енергетичний баланс під час метаболічного стресу шляхом підтримання внутрішньоклітинного співвідношення АМФ/АТФ [21]. В умовах виснаження енергії внутрішньоклітинний рівень АМФ зростає, тоді як рівень АТФ знижується, що призводить до збільшення співвідношення АМФ/АТФ та активації АМФК для відновлення клітинного рівня АТФ шляхом пригнічення анаболічних процесів і посилення катаболічних [22]. У разі надлишку енергії, наприклад за умови ВВГ, активація AMФK знижується, щоб стимулювати синтез білка, ріст клітин і накопичення енергетичних запасів [22]. Цікаво, що нещодавні дослідження показали, що інгібування КОР запобігає гострому ушкодженню нирок завдяки відновленню внутрішньоклітинних рівнів АТФ у моделі ішемії та реперфузійного ушкодження нирок [23, 24]. Деякі експериментальні дослідження також показали, що фебуксостат достовірно підвищує внутрішньоклітинні рівні АМФ на моделях ушкодження клітин, спричиненого ніацином, або ушкодження ниркових канальців, спричиненого оксоновою кислотою [25, 26]. У проведеному нами дослідженні внутрішньоклітинне співвідношення АМФ/АТФ зменшувалося в умовах ВВГ, а спричинене фебуксостатом інгібування КОР переважно підвищувало внутрішньоклітинні рівні АМФ і в кінцевому підсумку активувало АМФК завдяки збільшенню внутрішньоклітинного співвідношення АМФ/АТФ. Однак отримані результати не свідчать про пряме відновлення внутрішньоклітинних рівнів АТФ в результаті інгібування КОР у КЕК в умовах ВВГ. Ці розбіжності можна пояснити відмінностями в дизайні досліджень, у тому числі різною тривалістю впливу стимулів і лікування, а також різними моделями захворювань, таких як ДХН або ушкодження внаслідок ішемії-реперфузії.
Пуринові нуклеотиди виконують у клітині різні функції, у тому числі накопичення та транспортування енергії, участь у сигнальних шляхах, слугують попередниками нуклеїнових кислот, а також кофакторами в численних метаболічних реакціях [27]. КОР відіграє важливу роль у катаболізмі пуринів, зокрема в синтезі необоротних проміжних продуктів, таких як ксантин і сечова кислота, які блокують шлях реутилізації пуринів [28]. Таким чином, інгібування КОР може зменшувати утворення КОР-похідних АФК, сприяючи повторному використанню гіпоксантину та продукуванню АТФ за участю шляху реутилізації пуринів [28].
Поточне дослідження зосереджувалося на вивченні зв’язків між AMФK, PGC‑1α, Noxs (Nox1, Nox2 і Nox4) і FoxOs як компонентів клітинної відповіді на оксидативний стрес при ДХН. PGC‑1α діє як головний регулятор транскрипції, беручи участь у біогенезі мітохондрій, окисному фосфорилюванні, вуглеводному і ліпідному метаболізмі та детоксикації АФК [30]. AMФK може безпосередньо взаємодіяти з PGC‑1α та активувати його, а активація AMФK сприяє PGC‑1α-залежній антиоксидантній відповіді [31, 32]. PGC‑1α також регулює активність FoxOs, особливо в процесі глюконеогенезу й антиоксидантного захисту клітини [30, 33]. Серед представників родини FoxO FoxO3a є прямою мішенню для PGC‑1α, а результатом їх взаємодії є регулювання експресії антиоксидантних генів [34]. Крім того, AMФK може безпосередньо впливати на FoxO3a, а сигнальний шлях AMPK-FoxO3a активує антиоксидантні ферменти, у тому числі тіоредоксин, пероксиредоксин, СОД‑2 і каталазу, що може зменшувати продукування АФК [35].
AMФK також відіграє вирішальну роль у регулюванні системи Nox, і в ході кількох експериментальних досліджень було показано, що активація AMФK призводить до зменшення оксидативного стресу і завдяки пригніченню Nox-похідних (зокрема, Nox4-похідних) АФК для захисту нирок від ушкодження [36-38]. Поточне дослідження підтвердило, що активація AMФK, індукована інгібуванням КОР, достовірно активує PGC‑1α і FoxO3a і пригнічує Nox1, Nox2 і Nox4. Крім того, виключення AMФK нівелює активацію PGC‑1α і FoxO3a та ослаблення продукування АФК у КЕК в умовах ВВГ. Отримані результати вказують на те, що захисний механізм інгібування КОР полегшується активацією AMФK та її низхідним шляхом, які пов’язані з механізмом антиоксидантного захисту при ушкодженні КЕК, індукованому ВВГ.
Висновки
Інгібування КОР захищає КЕК від ушкодження, спричиненого ВВГ, шляхом активації сигнального шляху AMPK-PGC‑1α-FoxO3a за участю HPRT1-залежного шляху реутилізації пуринів. Ці висновки наголошують на тому, що інгібування КОР завдяки активації AMФK захищає КЕК від АФК, які утворилися внаслідок ВВГ, і може бути терапевтичною мішенню для запобігання прогресуванню ДХН. Для остаточного підтвердження терапевтичної ролі інгібування КОР при ДХН необхідні подальші дослідження in vivo та клінічні дослідження з належним дизайном.
Список літератури – у редакції.
Реферативний огляд статті Keum-Jin Yang et al. Xanthine oxidoreductase inhibition ameliorates high glucose-induced glomerular endothelial injury by activating AMPK through the purine salvage pathway, Scientific Reports volume 14, Article number: 11167 (2024).
Підготувала Ганна Кирпач
Повну версію дивіться: https://www.nature.com/articles/s41598-024-61436-1
Тематичний номер «Діабетологія. Тиреоїдологія. Метаболічні розлади» № 2 (66) 2024 р.