26 вересня, 2025
Вплив фагоцитостимулювального ефекту нового ентеросорбенту на функціональний стан нейтрофільних гранулоцитів
Гострі кишкові інфекції є однією з поширених патологій шлунково-кишкового тракту, які можуть спричинити як розвиток ускладнень, так і виступати фактором ризику виникнення патологій, у т. ч. синдрому подразненого кишківника (СПК) [1, 2]. Постінфекційний СПК розвивається, за різними даними, в 10-20% пацієнтів [3] після перенесеного інфекційного ентериту [4]. За результатами низки досліджень продемонстровано, що 3-36% випадків кишкових інфекцій зумовлюють появу нових постійних симптомів СПК [5].
Етіологічно постінфекційний СПК часто є наслідком бактеріальних інфекцій, але мають значення також й інші фактори ризику, як-от роль генетичних чинників, активація імунної системи, метаболізм серотоніну та зміни мікробіому [6]. Водночас слід зазначити, що в етіопатогенезі СПК суттєву роль також можуть відігравати перенесені вірусні або паразитарні інфекції, нервове психоемоційне перенапруження та посттравматичний стресовий розлад. Інфекційні фактори вважаються первинними тригерами запальних захворювань кишківника, оскільки вони сприяють розвитку запального дебюту захворювання, а подальший його перебіг залежить від імунологічних факторів та індивідуальних особливостей організму. У відповідь на інфекційне ураження в кишківнику розвивається неспецифічна запальна реакція, яка супроводжується якісними та кількісними змінами у складі мікробіому (дисбіозом), а також її транслокацією через ушкоджений кишковий бар’єр. Ці порушення підсилюють та підтримують локальне запалення, отже, й зумовлюють підвищення проникності кишкової стінки з подальшим розвитком хронічної інтоксикації, синдром мальабсорбції, надмірну антигенну стимуляцію, зміни локальної імунної відповіді тощо.
Саме тому позитивний вплив препаратів, що застосовуються для лікування запальних процесів у кишківнику, на функціональні характеристики клітин, які беруть участь у первинній запальній реакції, є необхідною складовою патогенетичного лікування. Важливу роль у розвитку первинної локальної запальної реакції у кишківнику відіграють нейтрофільні гранулоцити (нейтрофіли) і перитонеальні макрофаги, основною функцією яких є фагоцитоз, тобто поглинання й знищення чужорідних часток, зокрема мікроорганізмів. Нейтрофільні гранулоцити та перитонеальні макрофаги – важливі компоненти імунної системи, які виконують різні функції. Нейтрофіли є першою лінією захисту організму від інфекційних чинників, зокрема бактеріальних і грибкових [7, 8], вони першими мігрують до місця запалення [9] та відіграють суттєву роль у процесах перитонеальної адгезії [10]. Перитонеальні макрофаги знаходяться в черевній порожнині та виконують функцію фагоцитозу, тобто знищення чужорідних часток, включаючи бактерії, а також здійснюють презентацію антигенів і секрецію цитокінів, які регулюють імунну відповідь, отже, й впливають на запальні процеси в черевній порожнині [11-13], тобто роль нейтрофільних гранулоцитів та перитонеальних макрофагів у розвитку запальної реакції у кишківнику за різних умов є добре дослідженою. Водночас у науковій літературі практично відсутні дані щодо впливу ентеросорбентів на показники функціональної активності нейтрофільних гранулоцитів і перитонеальних макрофагів.
Метою роботи було дослідження впливу фагоцитостимулюючого ефекту нового медичного виробу Альпесорб (Поліметилсилілсесквіоксану-Цинктм) на функціональний стан нейтрофільних гранулоцитів, визначений за допомогою НСТ-тесту.
НСT-тест є інтегральним показником біоцидної здатності нейтрофільних гранулоцитів, який дозволяє оцінити активність усіх складових кисневозалежної НАДФН-оксидазної системи клітин.
Проведення НСT-тесту в двох варіантах (спонтанному й індукованому ліпополісахаридом) надає можливість дійти висновків, з одного боку, щодо реактивності нестимульованих нейтрофільних гранулоцитів, а з іншого – стосовно їхнього функціонального резерву, тобто можливості реалізації завершеного фагоцитозу, отже, й стимуляції репараційних процесів.
Матеріали та методи
Експериментальні дослідження проведено в лабораторії культивованих клітин ННЦ «Інститут біології та медицини» Київського національного університету ім. Т. Шевченка [14]. Визначення активності медичного виробу Альпесорб (активна речовина – Поліметилсилілсесквіоксану-Цинктм/PPS-Zn) проводилося з використанням такого обладнання: шафа-ламінар (LS, ламінарні системи), СО2-інкубатор (Medcenter Einrichtungen GmbH MMM-Group), центрифуга (ОПН‑3), мультилунковий спектрофотометр (Labsystems Multiscan MS). Прижиттєве спостереження, оцінку морфологічних параметрів і візуалізацію нейтрофільних гранулоцитів та фагоцитів проводили з використанням інвертованого мікроскопа AxioVert (Carl Zeiss), обладнаного програмним забезпеченням AxioVision. Фотозйомку клітинних препаратів проводили з використанням цифрової фотокамери Digital Still Camera з об’єктивом Carl Zeiss Vario-Sonar.
Для визначення біологічної активності перитонеальних макрофагів застосовували спонтанний та стимульований НСТ-тест. Тест проводили в 96-лункових плоскодонних планшетах за обліку результатів спектрофотометричним методом за довжини хвилі 540 нм. Для цього готували зразки суспензії клітин для аналізу – розведення перитонеальних макрофагів щурів/моноцитів периферійної крові добровільних донорів у суспензії до концентрації 1×105 на лунку. Вносили отриману суспензію клітин на 96-лунковий планшет. У дослідні проби для визначення спонтанної активності вносили 0,1 мл нітросинього тетразолію (НСТ) у розведенні – 20 мг НСТ у 10 мл фосфатно-буферного розчину. Для визначення стимулювальної активності додавали 0,1 мл НСТ і 10 нг/мл форбол 12-меристат‑13-ацетатом (ФМА) як додатковий стимул за стандартних умов. Альпесорб (АС) додавали у концентраціях 5 мкг/мл. У контрольні лунки вносили тільки 0,1 мл фосфатного буферу. Клітини інкубували протягом 1 год за температури 37⁰ С в СО2-інкубаторі. Після інкубації планшет центрифугували протягом 10 хв за 400 g. Супернатант видаляли, а до осаду вносили 0,2 мл етанолу. Проводили повторне центрифугування за тих самих умов. Після видалення супернатанту в усі лунки додавали 0,1 мл КОН і 0,1 мл ДМСО, вміст акуратно піпетували. Облік результатів проводили спектрофотометричним методом за довжини хвилі 540 нм. Спонтанну активність перитонеальних макрофагів виражали в умовних одиницях. Відсоток стимуляції / пригнічення активності перитонеальних макрофагів розраховували за такою формулою:
(Ст–Сп)/Сп×100%,
де Сп – показник оптичної густини спонтанної проби; Ст – показник оптичної густини стимульованої форбол‑12-меристат‑13-ацетатом проби.
Клітини із фагоцитарною активністю (макрофаги перитонеальної рідини щурів) обробляли ліпополісахаридом (ЛПС), у позитивному контролі стимулювали фагоцитоз форболовим ефіром і визначали рівень стимульованої / пригнічувальної дії порівняно із фагоцитами, обробленими препаратами.
Статистичний аналіз проводили за допомогою непарного t-критерію для порівняння групових середніх. Відмінності між групами та концентраціями оцінювали за допомогою двобічного дисперсійного аналізу. Аналіз проводився за допомогою GraphPad Prism (версія 10.4.1; програмне забезпечення GraphPad, США). Р-значення <0,05 вважали статистично значущим.
Результати та обговорення
За даними оптичного поглинання, відсоток стимульованої активності фагоцитів за впливу ФМА становив 94±2% для медичного виробу Альпесорб.
На рисунку продемонстровано, що ЛПС сприяє вираженому достовірному (в >2 рази) пригніченню біологічної активності та життєздатності клітин (на противагу позитивному контролю зі стимуляцією форболовим ефіром). Дія медичного виробу Альпесорб в інкубаційному середовищі сприяла нормалізації показників біологічної активності макрофагів практично до рівня контрольної групи.
Рис. Біологічна активність перитонеальних макрофагів, визначена в НСТ-тесті за дії ЛПС, ФМА та медичного виробу Альпесорб
Примітки: АС – Альпесорб; ФМА – форбол‑12-меристат‑13-ацетат; ЛПС – ліпополісахарид; * – достовірність із групою контролю; # – достовірність між Альпесорбом та позитивним контролем.
Отримані результати вивчення біологічної активності перитонеальних макрофагів за допомогою спонтанного та стимульованого НСТ-тесту свідчать про значну відновлювану активність медичного виробу Альпесорб щодо життєздатності клітин [14]. Позитивний вплив медичного виробу Альпесорб на функціональну активність нейтрофільних гранулоцитів і перитонеальних макрофагів, своєю чергою, надає підстави передбачати значний потенціал нового ентеросорбенту Альпесорб з активною речовиною Поліметилсилілсесквіоксану-Цинктм у лікуванні інфекційно-запальних захворювань кишківника, зокрема, за рахунок наявності в нього цитопротекторних та репаративних властивостей [14]. Як свідчать дані дослідження, медичний виріб Альпесорб чинить позитивний вплив на один із ключових механізмів локального запального процесу та сприяє відновленню функціонального складу нейтрофільних клітин і макрофагів, які є важливими компонентами імунної системи.
В інтерпретації отриманих результатів також слід ураховувати описані в літературі цитопротекторні, антиоксидантні та протизапальні ефекти іонів цинку, що входять до складу медичного виробу Альпесорб [15-17].
Отримані результати свідчать, що цитопротекторна (фагоцитостимулююча) активність, ймовірно, залежить не так від прямого сорбційного механізму дії ентеросорбенту, як від його структурних особливостей та фізіологічних властивостей, що також варто враховувати при клінічному застосуванні.
В подальших дослідженнях засобів перспективного класу ентеросорбентів-мукопротекторів при запальних хворобах кишківника необхідно насамперед дослідити їхній вплив на проникність кишкового бар’єра іn vivo в умовах запалення, що надасть змогу визначити пряму цитопротекторну властивість та обґрунтувати доцільність використання ентеросорбентів певної структури при запальних процесах в кишківнику.
Висновки
У проведеному дослідженні встановлено позитивний вплив ентеросорбенту Альпесорб на стимуляцію фагоцитозу, визначену за допомогою НСТ-тесту, що свідчить про його значний відновлюваний вплив на життєздатність клітин і відновлення біоцидності макрофагів. Досліджений ентеросорбент Альпесорб продемонстрував практично 100% ефективність у стимуляції фагоцитозу в умовах наявності факторів активації нейтрофілів і макрофагів, визначену за допомогою НСТ-тесту, що може пояснюватися не лише його механізмом дії, а й особливостями структури. Також у цьому дослідженні підтверджено можливість застосування НСТ-тесту як методу скринінгу для препаратів із потенційними протизапальними та репаративними властивостями.
Отримані дані дозволяють дійти висновку щодо непрямої протизапальної, цитопротекторної та репаративної дії медичного виробу Альпесорб в умовах наявності факторів активації нейтрофілів і макрофагів, а також свідчать про доцільність подальшого вивчення протизапальних ефектів ентеросорбентів та диференційованого підходу при їхньому застосуванні з метою лікування запальних захворювань кишківника.
Список літератури знаходиться в редакції.
Медична газета «Здоров’я України 21 сторіччя» № 18 (604), 2025 р