2 квітня, 2017

Использование микрофлюидной технологии в исследовании системы гемостаза

Автори:

А.А. Мельник, к.б.н., г. Киев

Согласно данным Центра по контролю и профилактике заболеваний США (Centers for Disease Control and Prevention, CDC), ежегодно в мире на лабораторную диагностику расходуется более 100 млрд долларов. Это обусловлено тем, что лабораторные методы предоставляют врачам-клиницистам около 80% всей диагностической информации. Если в 1970 г. лабораторная диагностика имела в своем арсенале 81 лабораторный тест, а в 2000-м – 170 тестов, то к настоящему времени их количество приближается к 1 тыс. аналитов. Сегодня лабораторная диагностика располагает значительным объемом данных о молекулярных механизмах многих происходящих в живом организме процессов. Это заставляет изобретать и развивать новые информативные лабораторные методы диагностики. Одним из таких инновационных методов является микрофлюидная технология.

Микрофлюидная технология

В конце 80-х гг. XX века профессор A. Manz предложил концепцию создания аналитических систем на микрочиповой платформе или микрофлюидных чипах (МФЧ) [1]. Эти системы представляют собой синтез микрофлюидных аналитических систем и интегральных схем. Их называют «lab-on-a-chip» (лаборатория на чипе) или mTAS «micro Total Analysis Systems» (миниатюризованные системы полного анализа). Термины «lab-on-a-chip» и «mTAS» являются синонимами. В МФЧ основные стадии анализа (загрузка, транспортировка пробы и реагентов, фильтрация и концентрирование пробы, химические реакции, разделение продуктов, детектирование аналита и т.д.) можно реализовать на одной компактной подложке. МФЧ востребованы как современный аналитический инструмент в научных исследованиях, биотехнологии, медицине, криминалистике, экологии и т. д. [2-4]. Одним из первых аналитических методов, реализованных на МФЧ, был метод капиллярного электрофореза [5]. В настоящее время наиболее развиты электрофоретические и электрохроматографические методы разделения пробы на МФЧ, которые применяются для экспресс-анализа ДНК и РНК, секвенирования ДНК [6], анализа белков [7], неорганических и органических веществ [8], иммунного анализа [9]. Создаются интегрированные микрофлюидные системы, в которых совмещено сразу несколько функциональных устройств и модулей. К основным преимуществам mTAS относятся:

мобильность;
износостойкость;
высокая чувствительность;
снижение расхода реагентов;
низкое энергопотребление;
короткое время получения результатов;
меньшее пространство, занимаемое в лаборатории;
дешевое серийное производство;
управляемая диффузия;
высокоскоростная последовательная обработка результатов.

Микрофлюидные устройства для мониторинга гемостаза

Чтобы избежать серьезных осложнений, связанных с кровотечением или тромбозом, во многих клинических ситуациях (хирургическое вмешательство, травма, сепсис, применение антикоагулянтной и антитромбоцитарной терапии) необходим быстрый и точный мониторинг системы гемостаза [10-12]. Во всем мире растет число пациентов, нуждающихся в применении экстракорпоральных вспомогательтельных устройств (гемодиализ, мембранная оксигенация, механическая поддержка кровообращения и др.), для которых требуется точный и персонализированный антикоагулянтный мониторинг в режиме реального времени с возможностью сохранения гемостаза в естественных условиях с целью предотвращения образования сгустков на пути транспорта крови [13,14]. Большинство из этих устройств не способно точно и непрерывно осуществлять дозирование антикоагулянта, что часто приводит к большому кровотечению и в конечном итоге – к смерти [15]. Кроме того, для осуществления мониторинга гемостаза у постели больного требуется использование небольшого объема крови, что особенно критично у детей с острой коагулопатией (приобретенной или врожденной), так как дети более уязвимы, чем взрослые [16-18].

В течение последних нескольких лет были разработаны различные тесты и анализаторы для оценки свертывания крови и определения функции тромбоцитов in vitro. Эти тесты включают такие показатели, как время кровотечения, активированное время свертывания (АВС), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ), тромбоэластография, агрегометрия тромбоцитов и многие другие. Несмотря на то что применение данных тестов обеспечивает предоставление полезной информации о состоянии коагуляционного статуса или функции тромбоцитов, они имеют существенные ограничения с точки зрения их способности предсказывать тромбоз или риск кровотечения в различных клинических случаях. Это связано с тем, что в указанных тестах отсутствуют многие ключевые для контроля гемостаза показатели, имеющиеся в естественных условиях (in vivo). Главный недостаток этих тестов заключается в измерении свертывания крови статически (не в потоке) или в не соответствующих условиях потока крови. При этом не учитывается влияние гемодинамической силы (давление, текучесть, напряжение сдвига) и связанное с этим обстоятельством клеточное взаимодействие, которое, как известно, ведет к образованию тромбов в сосудах [19]. Было показано, что инициация агрегации тромбоцитов при артериальном тромбозе in vivo и свертывание в экстракорпоральных устройствах обычно происходят в местах резкого возмущения потока, в точках застоя крови и на стенозированных участках [20,21]. Однако ни один из рутинных тестов для исследования гемостаза не учитывает эти физиологические условия для оценки свертывания крови.

С этой целью были разработаны микрофлюидные устройства с камерами параллельного потока, имитирующими атеросклероз сосудов и воссоздающими физиологическую скорость сдвига, и градиенты с использованием цельной крови человека в комбинации с покрывающим поверхность внеклеточным матриксом (коллагеном) [22, 23]. В ходе исследования подтвердилось, что гемостаз индуцируется при контакте крови с матрицей в зависимости от скорости локального потока. К сожалению, результаты, полученные в процессе научных исследований, не были внедрены в клиническую практику, и прежде всего потому, что подобные устройства не предназначены для использования у постели больного и требуют специализированнных приборов и точной обработки изображения [24-27].

В работе А. Jain и соавт. [28] описано простое микрофлюидное устройство для мониторинга гемостаза и функции тромбоцитов в режиме реального времени. Оно позволяет быстро определить время свертывания нативной цельной крови путем перфузии через сеть каналов и имитирует локальные физиологически значимые изменения в гемодинамическом потоке при стенозе артерий. Важным в разработке этого микрофлюидного устройства является то, что каналы включают многочисленные области престеноза и постстеноза, что, в свою очередь, генерирует патофизиологический сдвиг скорости и градиента, которые действуют как гемодинамические активаторы в случае свертывания крови внутри устройства. Для точной оценки образования сгустка в автоматическом режиме производится изменение давления жидкости в случае увеличения окклюзии канала, что отслеживается устройством в режиме реального времени, а физиологическое «микрофлюидное» время свертывания выводится на экран монитора в виде количественной конечной точки с использованием новой математической модели. Такое устройство может быть напрямую интегрировано в сосуд, чтобы производить мониторинг гемостаза нативной крови в режиме реального времени.

Мониторинг гемостаза с использованием микроустройства

При перфузии цельной крови через микрофлюидное устройство, содержащее микроканалы, имитируется стеноз артерий (например, сужение из-за атеросклеротических бляшек). В первой области микроканалов создается внезапное ускорение жидкости (престеноз), следующая область – однородный сдвиг (область стеноза), после которой следует область микроканалов с внезапным замедлением (постстеноз) (рис. 1).

Вначале исследуемую цельную кровь вводят в специальный резервуар, после чего она распределяется по 12 параллельным каналам с последующим сходом потока через выходное отверстие. Общая ширина и длина устройства разработаны таким образом, чтобы соответствовать стандартному стеклянному слайду для проведения микроскопии изображения в режиме реального времени с использованием объектива с низким увеличением (рис. 2).

Каждый канал содержит несколько секций под углом 60º и прямыми участками для достижения максимально возможной области поверхностного контакта в процессе образования сгустка (производится три параллельных измерения на стеклянном слайде устройства) (рис. 3).

Неньютоновский компьютерный анализ крови, протекающей через устройство, подтверждает, что скорость сдвига быстро меняется при престенозе и постстенозе на дистанции 300 мкм и остается в основном однородной на прямом участке (рис. 4).

Существует линейная зависимость между скоростью сдвига (u) на прямом участке (определяется скоростью потока) и максимальным градиентом скорости (u*). При этом ускорение потока и торможение имеет следующую зависимость: u*=~3,5. На основе этого рассчитывается разность сдвига стенозированной области. Установлено, что эта разность соответствует изменениям, эквивалентным тем, которые получают, когда диаметр артериол уменьшается с 275 до 125 мкм или соответствует 55% стеноза, что типично для пациентов с атеросклерозом (рис. 5).

Микрофлюидный анализ времени свертывания крови

Для оценки возможности практического примения микрофлюидных систем в конкретных клинических ситуациях было проведено измерение времени свертывания на основе регрессионной модели. Для этого прежде всего исследовали чувствительность гепарина в диапазоне концентраций от 0 до 1 IU/мл. Обнаружено, что время свертывания крови линейно возрастало по мере повышения концентрации гепарина от 0 до 1 IU/мл как при низком 1,225 с‑1 мм‑1, так и при высоком 4,375 с‑1 мм‑1 уровнях сдвига градиента (рис. 6).

Полученные данные свидетельствуют, что устройство может быть использовано для надежной терапии гепарином в клинических условиях in vitro.

Быстрый тест определения функции тромбоцитов при стенозированном потоке in vitro

Доказано, что агрегация тромбоцитов служит основной причиной возникновения сосудистой окклюзии, поэтому данное устройство использовали для определения функции агрегации тромбоцитов при стенозированном потоке [29]. Это имеет ряд преимуществ. Во-первых, для проведения исследования, которое длится всего несколько минут, требуется небольшой объем цельной крови (<1 мл). Во-вторых, при покрытии микроканалов коллагеном, который, как известно, является агонистом тромбоцитов, наблюдается большое количество фибрина и агрегированных тромбоцитов в постстенозных областях. Это согласуется с тем, что градиент скорости сдвига в области замедления потока может вносить главный вклад в гемостатический ответ (рис. 7).

Мониторинг антиагрегантной терапии

При введении абциксимаба (ReoPro^®) в образцы крови здоровых людей в клинической дозе (от 0,5 до 20 мкг/мл) наблюдали дозозависимый эффект микрофлюидного времени свертывания. Увеличение времени свертывания было зафиксировано также у пациентов, которые проходили лечение двойной антиагрегантной терапией (аспирин и клопидогрель) по сравнению со здоровыми пациентами.

Синдром Германского-Пудлака

Данное устройство с коллагеновым покрытием применили для изучения образцов крови у пациентов с синдромом Германского-Пудлака. Это редкое заболевание, при котором возникает кровотечение из-за недостатка плотных гранул в тромбоцитах. Важно отметить, что при использовании традиционного метода агрегации тромбоцитов (а именно анализатора PFA‑100) у пациентов с синдромом Германского-Пудлака дефекта тромбоцитов не было обнаружено. Когда же в устройство была перфузирована кровь двух пациентов с синдромом Германского-Пудлака, то при применении высокого градиента скорости сдвига 8,750 с‑1 мм‑1 образования сгустка не наблюдалось. Это показывает, что сдвиг активированного градиента является высокочувствительным при определении дефектов тромбоцитов у таких пациентов и может эффективно использоваться для диагностики заболевания.

Все эти данные доказывают правильность концепции анализа времени свертывания, суть которой заключается в том, что микрофлюидное устройство чувствительно при адгезии тромбоцитов к коллагену и модулирует активацию тромбоцитов, мишенью которых являются рецепторы P2Y12, αIIbβ3, циклооксигеназный путь.

Выводы

Биометрическое устройство для мониторинга гемостаза обладает несколькими потенциальными преимуществами по сравнению с другими аналитическими системами:

Багодаря наличию полного кровотока и стенозированной скорости сдвига в устройстве образование сгустков происходит при практически физиологических условиях и включает комплексную реологию крови, что имеет решающее значение для тромбоза. Хотя устройство изготовлено для создания фиксированного 55% стеноза в каждом канале и не может изменяться (как это происходит в условиях in vivo), тем не менее существует возможность применить скорость градиента сдвига для имитации у каждого конкретного пациента в завимости от его состояния. Например, при анализе крови пациентов с атеросклерозом, имеющих более высокую степень стеноза, документированную клинически, это можно осуществить с помощью более высоких градиентов сдвига, больше соотвествующих тяжести заболевания.
Образование сгустка может быть зафиксировано количественно в режиме реального времени с использованием помпы, сенсорного датчика давления и монитора, которые составляют часть устройств, применяющихся в экстракорпоральных системах и широко используемых сегодня в медицинской практике [30, 31].
Одним из важных преимуществ устройства является использование в нем параллельных стенозных каналов. Они лучше имитируют свертывание в естественных сосудах, чем один очень длинный канал. Применение многочисленных параллельных каналов в сочетании с математической обработкой данных позволяет использовать их как цифровой фильтр. Это способствует преодолению сложностей при расшифровке ответа, которые могут возникать в единичных каналах (например, прохождение частиц, пузырьков воздуха или других локальных возмущений).
Устройство позволяет эффективно мониторировать функцию тромбоцитов в цельной крови при анализе риска кровоточений у трудно диагностируемых пациентов. Являясь глобальным тестом мониторинга гемостаза, это устройство предполагает анализ потенциальных комплексных коагулопатий, таких как сепсис и серповидно-клеточная анемия, где бактерии и серповидные эритроциты способствуют изменениям в системе гемостаза.
Устройство может быть функционально интегрировано в экстракорпоральные медицинские изделия, что обеспечит более простой и надежный способ мониторинга коагулопатий и анализ проявления действия антитромботической терапии в течение долгого времени в отделениях реанимации, интенсивной терапии или непосредственно у постели больного.

Таким образом, микрофлюидное устройство для исследования гемостаза является новым удобным методом глобального анализа функции тромбоцитов, мониторинга антитромбоцитарной терапии и оценки состояния здоровья пациентов с нарушениями свертываемости крови.

Список литературы находится в редакции.

Медична газета «Здоров’я України 21 сторіччя» № 5 (402), березень 2017 р.

Номер: Медична газета «Здоров’я України 21 сторіччя» № 5 (402), березень 2017 р.