19 жовтня, 2017
Рак молочної залози: фундаментальні та клінічні засади персоналізованого дизайну діагностики і лікування
Якщо ураган «Марія» являє собою біду для мешканців Карибського архіпелагу, то рак молочної залози (РМЗ), на жаль, є загрозою для жінок усієї планети, оскільки кількість хворих на цю онкологічну патологію та померлих від неї не зменшується. За статистикою ВООЗ, у всьому світі щорічно реєструється понад 1 млн нових випадків захворювання й помирає більше 400 000 жінок. Найвищі показники захворюваності на РМЗ зареєстровані у США, Канаді, Франції, Ізраїлі, Швейцарії, країнах Прибалтики. Згідно з бюлетенем Національного канцер-реєстру України, у 2014 р. в Україні перебувало на обліку близько 140 000 хворих на РМЗ.
Золотим стандартом лікування хворих зазначеної локалізації були й залишаються хірургічне втручання, променева і хіміотерапія як самостійні методи та в різних їх комбінаціях. Водночас результати стандартизованих методів лікування досягли певної межі ефективності в підвищенні виживаності та якості життя хворих на РМЗ. Розв’язати цей гордіїв вузол намагаються як клініцисти, так і науковці.
Фундаментальні розробки – ключ до вирішення нагальних проблем клінічної онкології
Школа дослідників Р.Є. Кавецького зробила свою ставку на поглиблення фундаментальних досліджень, присвячених особливостям взаємовідносин пухлини та організму, які можуть бути вагомою платформою для персоналізованого дизайну діагностики й моніторингу перебігу хвороби на всіх етапах лікування хворих. Серед численних пріоритетів наших досліджень важливою ланкою залишалась і глобальна проблема сучасності – резистентність до медикаментозних засобів.
Завдяки застосуванню маркерів молекулярної діагностики та вивченню морфологічних особливостей було з’ясовано, що мембрана резистентних клітин характеризується більш складною будовою як у внутрішньому інтер’єрі, так і в зовнішній топології великого різноманіття рецепторів та сайтів зв’язування різних доменів. Так, зокрема встановлено, що резистентним до цитотоксичної дії доксорубіцину клітинам РМЗ людини лінії MCF‑7 притаманне збільшення кількості Е-кадгерин-позитивних клітин та поява на поверхні мембран більшості клітин білка міжклітинної адгезії CD44, що свідчить про посилення їх адгезивних властивостей порівняно з клітинами вихідної чутливої лінії. Крім того, встановлено, що резистентні до цитотоксичної дії доксорубіцину клітини РМЗ людини характеризуються зниженим проліферативним потенціалом, який корелює з підвищенням експресії білка-інгібітора клітинного циклу р21 та зниженням числа клітин, що експресують циклін D1, білки pRb та c-myc. У резистентних клітинах відбувається ускладнення ультраструктурної організації, яке пов’язано з підвищенням ступеня їх диференціювання.
Наразі важливу роль у формуванні клітинного різноманіття за молекулярно-генетичними та метаболічними характеристиками відводять мікроРНК – класу малих некодуючих РНК, які на посттранскрипційному рівні регулюють експресію генів, що задіяні в регуляції клітинного циклу, диференціюванні, інвазії та впливають на апоптоз. Суттєвою перевагою цих біомаркерів, порівняно з іншими, є тканинна специфічність та стабільність як у плазмі крові, так і в пухлинній тканині.
Власними дослідженнями вперше встановлено, що при формуванні лікарської резистентності до протипухлинних препаратів відбуваються значні зміни профілю мікроРНК. Зокрема, у системі in vitro на клітинних лініях РМЗ людини зафіксовано зниження експресії низки мікроРНК (let 7a, let 7f, let 7d, mir‑34a, mir‑15b, mir‑149), які контролюють експресію генів-транспортерів (mdr1, mrp1), генів репарації ДНК (BRCA1, BRCA2), та підвищення експресії мікро-РНК (mir‑214, mir‑28, let 7i), що контролюють гени – регулятори апоптозу. Отримані дані свідчать, що дерегуляція мікроРНК є однією з характерних ознак злоякісно трансформованих клітин і відіграє важливу роль у формуванні стійкості до різних за механізмом дії протипухлинних препаратів. Водночас установлено, що цілеспрямоване інгібування білка легкого ланцюга феритину мікроРНК miR‑133a збільшує чутливість резистентних клітин MCF‑7/DOX і MCF‑7/CP до доксорубіцину й цисплатину.
Серед численних механізмів і факторів, що сприяють формуванню резистентного фенотипу клітин, нами доведено значну роль гомоцистеїну (ГЦ) – сірковмісної амінокислоти, що утворюється шляхом деметилювання метіоніну. Важливість таких досліджень пов’язана з тим, що зниження статусу метилювання ДНК є одним з головних регулюючих механізмів експресії багатьох генів, задіяних у канцерогенезі, та першою розпізнавальною ознакою епігенетичних змін у трансформованих клітинах людини. З метилюванням ДНК у пухлинних клітинах пов’язана прогресія росту злоякісних пухлин, зокрема метастазування, та формування лікарської резистентності до дії цитостатиків.
Власними дослідженнями в системі in vitro встановлено, що культивування пухлинних клітин РМЗ людини лінії MCF‑7 з підвищеними концентраціями екзогенного ГЦ супроводжується значними змінами їх морфофункціональних характеристик і свідчить про наявність дозозалежного ефекту. Під впливом гіпергомоцистеїнемії збільшуються розміри клітин, зростає ядерно-цитоплазматичне співвідношення, кількість ядерець (до 3-4), порушується ступінь диференціювання. Поряд з цим суттєво змінюються міжклітинні адгезивні властивості, мембранно-транспортні процеси, активність антиоксидантних та детоксикаційних систем, співвідношення білків цитоскелету, які визначають молекулярний профіль клітин. Ці зміни свідчать про те, що під впливом підвищеної концентрації ГЦ пухлинні клітини швидко набувають ознак фенотипу резистентності до протипухлинних препаратів, аналогічних тим, що визначалися нами в клітинах цього гістогенезу в умовах дії наростаючих концентрацій доксорубіцину й цисплатину.
В експериментальних дослідженнях, спрямованих на визначення впливу гіпергомоцистеїнемії на ріст злоякісних пухлин у системі in vivo на моделі карциносаркоми Уокер‑256, встановлено, що ріст карциносаркоми Уокер‑256 супроводжується підвищенням концентрації ГЦ у плазмі крові тварин у період експоненційного росту пухлин та зниженням – у термінальній стадії їх росту. При цьому існує прямий кореляційний зв’язок між зростанням концентрації ГЦ у плазмі крові та зниженням рівня загального метилювання ДНК у тканині пухлини.
За умов метіонін-індукованої гіпергомоцистеїнемії гальмуються ріст та метастазування пухлин, що відбувається на тлі зниження рівня загального метилювання ДНК у пухлинній тканині та посилення процесів тромбоутворення в судинах пухлин. Нами доведено, що серед засобів, які можуть бути використані для корекції гіпергомоцистеїнемії, найбільш ефективним є комплекс вітамінів групи В – В6, В9 та В12.
Його застосування дає змогу не лише знизити вміст ГЦ у плазмі крові, але й запобігти загальному гіпометилюванню ДНК, що може бути використано для підвищення ефективності лікування хворих на РМЗ. За результатами досліджень видані методичні рекомендації «Корекція порушень обміну гомоцистеїну у хворих на рак молочної залози».
Дослідження причин такого біологічного явища, як внутрішньоклітинна гетерогенність, в основі якої лежить генетична нестабільність, дозволили виявити нові молекулярно-генетичні маркери, що відображають особливості патогенезу раку на системному рівні. У цьому аспекті все більшої актуальності набуває вивчення порушень функціонування залізовмісних білків, які відіграють важливу роль на різних етапах канцерогенезу, а також можуть ініціювати виникнення резистентності до цитостатиків. Поряд із цим є дані, які свідчать про синергізм змін метаболізму заліза та естрогенів при виникненні РМЗ.
Результати власних досліджень у системі in vitro на пухлинних клітинах лінії MCF‑7 засвідчили, що в пухлинних клітинах, резистентних як до цисплатину, так і до доксорубіцину, відбувається гіперметилювання промотора гена рецептора трансферину І, а також змінюється рівень експресії білків – регуляторів обміну ендогенного заліза (рецептор трансферину, трансферин, легкі й важкі ланцюги феритину, феропортин і гепсидин). Показано, що в клітинах лінії MCF‑7, резистентної до доксорубіцину, визначається більш високий статистично достовірний рівень гепсидину порівняно з чутливими клітинами. Високий рівень гепсидину в резистентних клітинах асоціюється з відсутністю експресії рецепторів естрогенів та прогестерону, зменшенням адгезивних властивостей, підвищенням вмісту вільного заліза та зростанням інвазивних характеристик клітин. Отримані дані свідчать, що одним з механізмів формування медикаментозної резистентності до різних за механізмом дії протипухлинних препаратів є порушення обміну заліза на рівні метилювання генів – регуляторів обміну заліза.
Результати дослідження експресії лактоферину (ЛФ) – протеїну із сімейства залізовмісних білків-транспортерів – на клітинних лініях РМЗ людини з різною чутливістю до цитостатиків характеризуються різним рівнем його вмісту. Так, зокрема, найбільш високий рівень експресії ЛФ визначено у клітинних лініях T47D та MCF‑7, які мають найменший інвазивний потенціал. Нижчі показники експресії ЛФ притаманні клітинам ліній MDA-MB231 та MDA-MB468 з високою інвазивною активністю. Встановлено зв’язок між рівнем експресії ЛФ у резистентних клітинах ліній MCF‑7/CP та MCF‑7/Dox, особливостями їх молекулярного профілю, а також інвазивними властивостями. Дія екзогенного
ЛФ на зазначені клітини призводить до модулюючого ефекту, про що свідчать зміни їх молекулярного профілю та інвазивні властивості. Установлено феномен інгібуючої дії ЛФ на експресію протеїнів, асоційованих з лікарською резистентністю. Водночас при культивуванні пухлинних клітин РМЗ людини, резистентних до цитостатиків, спостерігалося суттєве підвищення їх чутливості до доксорубіцину й цисплатину.
Дослідження функціонального стану металовмісних протеїнів у процесі формування резистентного фенотипу карциносаркоми Уокер‑256 у експериментальних тварин показало, що на всіх етапах формування резистентності до доксорубіцину в пухлинній тканині піддослідних тварин відбувається суттєве підвищення вмісту протеїнів – трансферину та феритину, що задіяні у транспорті та депонуванні заліза, порівняно з тваринами, яким доксорубіцин не вводили. Водночас у сироватці крові цих тварин виявлено зниження рівня феритину на початковому етапі формування резистентності до доксорубіцину та суттєве підвищення за сформованого резистентного фенотипу пухлини. Протилежний характер змін виявлено щодо вмісту трансферину. Суттєвими є дані про те, що в процесі розвитку резистентності до доксорубіцину в пухлинній тканині зростає рівень вільного заліза, який вірогідно корелює з підвищенням генерації активних форм кисню та концентрацією активних форм матриксних металопротеїназ – ММП‑2 та ММП‑9. Поряд з цим поступово збільшується вміст непротеїнових SH-груп у пухлині. У сироватці крові на початку формування резистентності відбувається значне зростання активних форм церулоплазміну і різке їх зниження на етапі повної втрати пухлиною чутливості до доксорубіцину. Отже, феномен формування резистентності карциносаркоми Уокер‑256 супроводжується як дерегуляцією металовмісних протеїнів у сироватці крові та пухлинній тканині, так і зміною активності системи антиоксидантного захисту. Таким чином, у результаті проведеного дослідження окреслено коло металовмісних протеїнів, які задіяні у формуванні резистентного фенотипу пухлин та можуть слугувати мішенню для підвищення їх чутливості до дії доксорубіцину.
Поряд з охарактеризованим напрямом робіт в ІЕПОР започатковано серію досліджень з нанотехнологій – одного із сучасних багатонадійних напрямів, який посів чільне місце в онкології і спрямований на створення нових модифікуючих протипухлинних засобів для підвищення ефективності лікування хворих на резистентні форми онкологічної патології, зокрема РМЗ. У процесі наукової розробки на основі наночастинок магнітної рідини та цисплатину створено протипухлинний нанокомпозит, який як джерело іонів заліза у вигляді наноматеріалів виступає в ролі: 1) потенційного вектора доставки цитостатика; 2) екзогенного модифікатора обміну ендогенного заліза; 3) фактора вибірковості накопичення та подолання резистентності до протипухлинного препарату.
Вивчення впливу створеного нами нанокомпозиту, до складу якого входить цисплатин, на клітинні лінії РМЗ людини показало, що нанокомпозит має більші переваги щодо цитотоксичного ефекту порівняно з офіцинальним цисплатином при дії на клітини вихідної і резистентної ліній молочної залози людини MCF‑7. Нанокомпозит здатний ініціювати апоптичну програму в більш вираженій формі в резистентній лінії клітин РМЗ не лише за рахунок змін рівня про- та антиапоптичних білків, а й шляхом впливу на функціональну активність мітохондрій. Крім того, він здатний спричиняти структурно-функціональні порушення мембран резистентних клітин за рахунок зниження вмісту холестеролу на 29% та підвищення у 2 рази співвідношення фосфатидилхолін/сфінгомієлін. Зазначені зміни свідчать про підвищення плинності мембран клітин резистентної лінії, а отже – про збільшення їх проникності під впливом нанокомпозиту.
Порівняльне вивчення протипухлинної активності нанокомпозиту, створеного на основі наночастинок магнітної рідини та цисплатину, показало, що в системі in vivo терапевтичний ефект нанокомпозиту перевищує результати дії офіцинальної форми цисплатину. Прояви побічної дії нанокомпозиту на організм тварин, зокрема нефро-, гепато- та гемотоксичність, не перевищують показників токсичності цисплатину. Крім того, встановлено, що токсичність нанокомпозиту на клітини органів ретикуло-ендотеліальної системи, печінки та системи крові є толерантнішою за дію цисплатину.
Як виявилося, нанокомпозит, введений тваринам у терапевтичному режимі, здатний змінювати ліпідний профіль плазматичних мембран клітин резистентної карциносаркоми Уокер‑256 шляхом суттєвого зменшення вмісту холестеролу в плазматичних мембранах та збільшення співвідношення фосфатидилхолін/сфінгомієлін, що сприяє більш інтенсивному накопиченню препарату в пухлинних клітинах. Ці дані узгоджуються з результатами досліджень, отриманих у системі in vitro.
Отже, експериментально в системах in vitro та in vivo доведено ефективність та необхідність використання створеного в ІЕПОР нанокомпозиту для підвищення вибірковості дії цисплатину на пухлинні клітини та подолання медикаментозної резистентності.
Доклінічні дослідження продемонстрували, що за показниками протипухлинної та антиметастатичної дії цей композит не лише не поступається офіцинальному препарату платини, а ще й суттєво перевершує його за ефективністю, особливо при формуванні лікарської резистентності.
Реальні кроки реалізації стратегії персоналізованого лікування хворих на РМЗ
Власними дослідженнями на клінічному матеріалі хворих на РМЗ доведена участь залізовмісних білків у формуванні ступеня злоякісності та чутливості пухлин до протипухлинних засобів. У хворих на РМЗ з І та ІІ стадією захворювання проведено оцінку значущості показників гепсидину на рівні пухлини й організму в клінічному перебігу захворювання. Результати кореляційного аналізу засвідчили, що зростання експресії пухлинного та рівня сироваткового гепсидину асоціюється зі ступенем злоякісності процесу за клініко-морфологічними характеристиками. Встановлено прямий кореляційний зв’язок між експресією гепсидину в пухлинах та стадією захворювання, метастатичним ураженням регіонарних лімфатичних вузлів, базальним молекулярним підтипом РМЗ та зворотний кореляційний зв’язок зі ступенем диференціювання пухлин. Рівень сироваткового гепсидину також прямо корелює зі стадією процесу, протоковою будовою пухлини, базальним молекулярним підтипом і обернено корелює з рівнем гемоглобіну.
Пріоритетними є дані про існування зв’язку між рівнем сироваткового гепсидину й циркулюючої мікроРНК‑122 та чутливістю хворих на РМЗ до неоад’ювантної поліхіміотерапії, про що свідчить достовірне підвищення у 2,6 раза сироваткового гепсидину та достовірне зниження у 2,2 раза експресії мікроРНК‑122 у пацієнток з резистентними до хіміотерапії пухлинами. Встановлено, що висока експресія гепсидину в пухлині та високий рівень сироваткового гепсидину вказують на агресивний перебіг РМЗ. Доведено, що високий рівень сироваткового гепсидину й низький рівень експресії циркулюючої мікроРНК‑122 асоціюються з резистентністю пухлин РМЗ до неоад’ювантної поліхіміотерапії.
Отже, на підставі комплексу експериментальних і клінічних досліджень обґрунтовано можливість використання показників гепсидину та мікроРНК‑122 як маркерів моніторингу пухлинного процесу та чутливості РМЗ до доксорубіцину в режимі неоад’ювантної поліхіміотерапії. Результати проведеного фрагменту досліджень у хворих на РМЗ можуть бути використані для системної оцінки стану гомеостазу заліза у таких пацієнтів, більш детальної характеристики молекулярного фенотипу пухлин та моніторингу перебігу захворювання.
У дослідженні, присвяченому перспективам використання мікроРНК як предиктивних і прогностичних маркерів РМЗ, визначено профіль циркулюючих та пухлинних мікроРНК, асоційованих з агресивністю клінічного перебігу захворювання. У хворих на тричі негативний РМЗ спостерігався високий рівень циркулюючих онкогенних мікроРНК‑10b та -155, що корелює з наявністю віддалених метастазів.
Характерною ознакою РМЗ базального підтипу новоутворень є зниження рівня мікроРНК‑29с та підвищення рівня мікроРНК‑199а у пухлинних клітинах. У клітинах люмінальних та Her2/neu-позитивного РМЗ визначається високий рівень онкосупресорних мікроРНК‑342 та -520. Зниження експресії онкосупресорної мікроРНК‑31 і підвищення рівня онкогенної мікроРНК‑27а у пухлинній тканині РМЗ корелює з низькими показниками загальної та безрецидивної виживаності хворих. Поряд з цим доведено, що показники експресії циркулюючих мікроРНК‑125b та -205 можуть бути використані для моніторингу ефективності хіміотерапії таксанами у хворих на РМЗ базального підтипу. Пригнічення експресії онкосупресорних мікроРНК‑200b та -200с, визначене у біопсійному матеріалі хворих, корелює з чутливістю до неоад’ювантної терапії антрациклінами. Подальші дослідження ролі мікроРНК у формуванні молекулярного профілю пухлин та детермінації чутливості РМЗ до цитостатиків стануть підґрунтям для розробки нових діагностичних критеріїв і методичних підходів оцінки перебігу захворювання та ефективності персоналізованого лікування хворих.
Співробітники ІЕПОР отримали суттєво важливі дані, які дозволили на підставі наявності дисемінованих пухлинних клітин (ДПК) у кістковому мозку та високого рівня біологічної активності цитокінів ФНП та М-КСФ у пунктаті кісткового мозку і периферичній крові визначити групи пацієнток з підвищеним ризиком виникнення рецидиву захворювання. Присутність ДПК у кістковому мозку хворих на РМЗ є важливим прогностичним чинником, оскільки визначається у хворих з прогресуванням пухлинного процесу. Наявність ДПК в кістковому мозку та високий рівень ФНП у кістковому мозку й периферичній крові асоціюються з гіперекспресією Her2/neu та негативним статусом стероїдних гормонів пухлинних клітин. Результати проведених досліджень показали, що виявлення ДПК та рівня цитокінів (ФНП, КСФ‑1, ІФН) у кістковому мозку і крові хворих на РМЗ може бути використано як важливий доопераційний комплекс маркерів для ідентифікації пацієнток з високим ризиком виникнення рецидиву захворювання та корекції схем лікування хворих.
На особливу увагу заслуговують дослідження, спрямовані на визначення ролі радіаційної компоненти в етіології РМЗ у первинних хворих, які не отримували передопераційного лікування і проживають на території Київської та Житомирської областей. Встановлено, що середня кількість клітин з хромосомними абераціями у лімфоцитах периферичної крові (ЛПК) обстежених хворих становила 5,71±0,7% і майже у 2 рази перевищувала верхню межу середнього популяційного рівня. Загальна частота аберацій хромосом у групі хворих на РМЗ становила 7,81±0,89 на 100 клітин, тобто 1,36 аберації на аберантну клітину, що також перевищувало контрольне значення цього показника.
Особливістю спектру спонтанних аберацій в ЛПК хворих є підвищена частота променевих маркерів – нестабільних аберацій обмінного типу (у 55% обстежених хворих), у тому числі діцентричних (1,0/100 клітин), кільцевих (0,1/100 клітин) і аномальних (0,11/100 клітин) хромосом. Отримані дані свідчать про внесок радіаційної компоненти в етіологію захворювання в обстежених хворих на РМЗ і можуть бути асоційовані з наслідками Чорнобильської катастрофи. Крім того, встановлено, що значна міжіндивідуальна варіабельність радіочутливості та високий відсоток (38%) гіперчутливих до опромінення хворих на РМЗ, виявлені при використанні хромосомного G2-тесту, асоційовані з мутаціями генів репарації подвійних розривів ДНК, які експресуються в G2/M-періоді клітинного циклу. Відмінності між радіочутливими і радіорезистентними хворими на РМЗ за цитогенетичними маркерами в периферичній крові, виявлені перед початком променевої терапії (хромосомний G2-тест), слід враховувати з метою ранньої діагностики захворювання, здійснення засобів профілактики розвитку РМЗ, оптимізації та індивідуалізації терапевтичного опромінення.
Поряд з пріоритетними фундаментальними дослідженнями різноманітних важелів корекції розвитку пухлинного процесу у хворих на РМЗ і можливості використання цих результатів у клінічній практиці ще одним знаменним здобутком ІЕПОР є аутовакцина, створена за результатами багатогранних експериментальних досліджень.
Протипухлинна аутовакцина (ПАВ) як засіб персоналізованого лікування онкологічних хворих, у тому числі на РМЗ, на підставі дозволу Вченої ради МОЗ України пройшла клінічну апробацію і може бути застосована після радикального видалення пухлинного осередку і проведення спеціалізованого лікування з метою профілактики розвитку рецидиву та метастазів. Ця вакцина містить пухлиноасоційовані антигени аутологічного тканинного матеріалу пухлини, які зазнали біотрансформації під впливом цитотоксичного лектину В. subtilis B‑7025. За даними Національного канцер-реєстру, персоналізовану біотерапію проведено 182 жінкам з РМЗ. Показники загальної 5-річної виживаності хворих на РМЗ після комплексного лікування із застосуванням ПАВ підвищуються на 35,8%, 10-річної – на 51,2%, а 15-річної – на 44,2% порівняно з контрольною групою пацієнток. ПАВ є унікальним біотерапевтичним засобом для персоналізованого запобігання виникненню та поширенню метастазів.
Таким чином, комплекс проведених досліджень у системі iт vitro, in vivo, ex vivo та результати аналізу клінічного матеріалу дозволяють розкрити різні прояви глибинних змін як у пухлинному осередку, так і на рівні всього організму, що є базовою платформою для формування персоналізованого дизайну діагностики й терапії хворих на РМЗ.
Спеціальний випуск тематичного номеру газети «Здоров’я України» «Онкологія, гематологія, хіміотерапія» 2017 р.