24 квітня, 2019
Результати проспективного подвійного сліпого дослідження фармакологічної активності Церебролізину та інших пептидних препаратів при лікуванні емболічного інсульту
Відкриття пептидних препаратів свого часу стало проривом у лікуванні захворювань центральної нервової системи. Нині продовжуються дослідження цих лікарських засобів, які можуть значно поліпшувати прогноз при такому тяжкому ураженні, як інсульт. До вашої уваги представлено огляд статті L. Zhang et al. «Prospective, double blinded, comparative assessment of the pharmacological activity of Cerebrolysin and distinct peptide preparations for the treatment of embolic stroke», опублікованої в Journal of the Neurological Sciences (2019; 398: 22‑26).
Інсульт є найпоширенішою причиною інвалідності, що призводить до розвитку сенсорних, рухових та координаційних порушень у 65% пацієнтів [1, 2]. Фармакологічні втручання за невідкладної допомоги особам з інсультом спрямовані на відновлення кровотоку з метою обмеження пошкодження мозку та постінсультних ускладнень, а терапія нейропротекторними препаратами застосовується для підтримання цих ефектів. Церебролізин® є нейропептидним засобом, дія якого подібна до такої ендогенних нейротрофічних факторів завдяки захисту мозку від шкідливого впливу ішемічного каскаду і внеску в процеси реорганізації головного мозку. Доклінічні дослідження продемонстрували такі аспекти модулювальної дії Церебролізину на нейропластичність, як:
- ремоделювання синаптичних зв’язків [3‑5];
- полегшення синаптичної передачі [6‑9];
- ріст нейритів [10, 11];
- олігодендрогенез [12, 13];
- нейрогенез [14‑19];
- сприятливий вплив на ендогенні процеси відновлення мозку [13‑15, 17, 19].
На експериментальних моделях інсульту було продемонстровано, що при гострому інсульті Церебролізин® дозозалежно зменшує об’єм вогнища ішемічного ураження та неврологічну симптоматику.
Наступні випробування показали, що відстрочене лікування Церебролізином прискорює відновлення після інсульту завдяки стимуляції сигнальних шляхів Sonic hedgehog і PI3K/Akt, які підсилюють процеси ремоделювання мозку. Більше того, у рандомізованих клінічних дослідженнях було продемонстровано позитивний вплив лікування Церебролізином на відновлення після інсульту при відмінному профілі безпеки та переносимості [20‑25].
Накопичено всебічні наукові дані, які демонструють нейропротекторні та нейрорепаративні ефекти Церебролізину в різних модельних системах інсульту та черепно-мозкової травми [13, 15, 26‑29]. На подібне претендують інші лікарські засоби, доступні на ринку, однак докази щодо їхньої ефективності досить обмежені або нечіткі. На думку авторів, немає публікацій про випробування, в яких би провели пряме порівняння ефекту окремих нейропротекторних пептидів для лікування інсульту та інших типів черепно-мозкової травми. Тому вони здійснили перше пряме порівняльне експериментальне дослідження із проспективним сліпим рандомізованим контрольованим плацебо дизайном для оцінки ефективності чотирьох пептидергічних препаратів щодо функціональних результатів після інсульту та об’єму вогнища інфаркту в аналогічній моделі інсульту.
Матеріали та методи
Усі експериментальні процедури були проведені згідно з рекомендаціями Національного інституту охорони здоров’я США (NIH) щодо утримання та використання лабораторних тварин. Також вони були схвалені Комітетом з утримання та використання лабораторних тварин лікарні Генрі Форда (Детройт, США) [30].
Дизайн експерименту
У дослідженні застосовували проспективний рандомізований контрольований плацебо сліпий дизайн. Рандомізація ґрунтувалася на змінному розмірі блоку і генерувалася за допомогою програмного забезпечення nQuery3.0. Приготування та введення препаратів, а також збирання та аналіз даних проводили незалежні працівники, які не були залучені до випробування.
Тваринна модель
Дорослим самцям щурів лінії Вістар (n=115) із масою тіла 350‑400 г проводили емболічну оклюзію правої середньої мозкової артерії (СМА) [31, 32]. Тромби з донорської крові нормальних щурів отримували за 24 год до оклюзії СМА. За допомогою модифікованого катетера PE‑50, заведеного під контролем із застосуванням хірургічного мікроскопа з правої зовнішньої у внутрішню сонну артерію до початку СМА, вводили згусток довжиною 40 мм і 2‑5 мкл фізіологічного розчину, після чого катетер негайно виводили. Розріз зашивали, а щурам дали змогу відновитися після анестезії.
Експериментальні групи та критерії включення у дослідження
Щури були рандомізовані в одну з п’яти експериментальних груп (по 23 тварини), що відрізнялися за терапевтичним втручанням:
- Когністар® (церебропротеїну гідролізат) у дозі 2,5 мл/кг.
- Церебролізат® (прим. ред.: Церебролізат зарєєстровано в Україні під торговою маркою Церегін) – гідролізат головного мозку великої рогатої худоби та свиней, що містить пептиди й амінокислоти, у дозі 2,5 мл/кг.
- Кортексин® у дозі 1,7 мг/кг.
- Церебролізин® (пептидний препарат, що виробляється з головного мозку свиней) по 2,5 мл/кг.
- Фізіологічний розчин у дозі 1 мл на щура.
Дозування визначали згідно з інструкцією для застосування відповідного препарату і адаптували до тваринної моделі, як описано раніше [29]. Внутрішньочеревний шлях введення був обраний на основі продемонстрованої в різних дослідженнях на тваринах терапевтичної ефективності церебролізину та інших зареєстрованих для продажу пептидергічних засобів у формі інтраперитонеальних ін’єкцій [29, 33‑35]. Перед початком лікування (вихідний рівень) неврологічні симптоми оцінювали через 3 години після оклюзії СМА, використовуючи 5-бальну шкалу Zea-Longa [36]. Тварини з оцінкою за Zea-Longa ≥2 бали (помірний до тяжкого неврологічний дефіцит) отримували лікування. Щури, які загинули за 24 год після оклюзії СМА (до першого неврологічного функціонального тесту), були виключені з наступних аналізів.
Досліджуваний засіб постачався в однакових непрозорих шприцах об’ємом 1 мл, позначених належним чином для підтримки осліплення випробування. Лікування починали через 4 год після оклюзії СМА; препарат вводили інтраперитонеально 1 раз на добу протягом 10 днів поспіль.
Поведінкові тести
Функціональний результат після інсульту оцінювали щотижня протягом місяця за допомогою модифікованої шкали для визначення тяжкості неврологічного дефіциту (mNSS), тесту на видалення клейкої стрічки (Adhesive Removal Test) та тесту на прослизання лапи (Foot-Fault Test), починаючи через день після здійснення оклюзії СМА. Дані щодо груп щурів були замаскованими для дослідника [14].
Шкала mNSS дозволяє оцінити моторні, сенсорні, балансові та рефлекторні функції від 0 (норма) до 18 балів (максимальний дефіцит) [37].
Тест на видалення клейкої стрічки полягає в тому, що на лапу щура наклеюють липку стрічку й визначають час, за який тварина позбавиться неї; він дозволяє оцінити соматосенсорне нерозпізнавання при двобічній тактильній стимуляції [38]. Для кожного щура в день тестування реєстрували середній час, необхідний для видалення подразника з контралатеральної (лівої) передньої кінцівки (час закінчення – 120 с).
Тест на прослизання лапи дозволяє оцінити дисфункцію реакції передніх кінцівок на тактильну й пропріорецептивну стимуляцію [39]. Реєстрували загальну кількість кроків (переміщення передніх кінцівок), які щур зробив на поверхні сітки, і кількість промахів (падінь або прослизань) для лівої передньої кінцівки, представляючи дані як частку промахів лівої кінцівки щодо загальної кількості кроків.
Гістологічне визначення об’єму вогнища інфаркту
Об’єм вогнища інфаркту визначали за допомогою 7 забарвлених гематоксиліном та еозином коронарних зрізів, зроблених для кожного із включених у дослідження щурів після смерті або наприкінці випробування (28 днів після оклюзії СМА). Дані представлено як частки об’єму іпсилатерального однобічного ураження від об’єму контралатеральної півкулі [40, 41].
Статистичний аналіз
Визначену на початку дослідження масу тіла щурів використовували для перевірки міжгрупового балансу до рандомізації. Мінливість маси було включено в аналіз результатів як коваріату, якщо був наявний дисбаланс між групами. Повторний аналіз вимірювань або аналіз дисперсії та коваріації (ANCOVA) використовували для вивчення змін маси у групах із часом.
Для оцінки безпеки застосовували логарифмічний ранговий критерій / метод Каплана – Меєра для перевірки відмінностей за смертністю між групами.
Для оцінки міжгрупових відмінностей за функціональним відновленням був використаний узагальнений тест, згідно з яким в оціночне рівняння включали результати всіх трьох вищевказаних поведінкових тестів (шкала mNSS, тест на видалення клейкої стрічки, тест на прослизання лапи) на 1, 7, 14, 21 і 28-й дні дослідження [42‑45].
Здійснюючи аналіз популяції всіх рандомізованих тварин, які отримали принаймні одну дозу досліджуваного препарату (ITT-аналіз), ранню смерть або погіршення стану, що перешкоджало функціональному тестуванню, визначали як найгірші результати. Отримані дані оцінювали щодо нормальності й ранжували, якщо вони не були належним чином розподілені. Групи, в яких тварини отримували Церебролізин® і фізіологічний розчин, вважалися контрольними, а дані щодо останньої групи застосовували для валідації ефекту Церебролізину та інших інтервенційних препаратів. Спочатку проаналізували загальний груповий вплив, а потім, якщо він був достовірним при рівні значимості 0,05, здійснювали парні порівняння. Будь-який аналіз підгруп вважався попереднім, якщо не спостерігалося загального групового ефекту.
Первинні (показники узагальненого тесту на основі трьох поведінкових тестів) та вторинні результати (об’єм вогнища ураження на 28-й день) були проаналізовані за допомогою 9-ї версії системи статистичного аналізу з використанням PROC GENMOD. Метод CONTRAST застосовували для оцінки середньої різниці між двома групами на основі рангових даних. Значуще функціональне поліпшення спостерігалося, якщо середня ранжована різниця була негативною зі значенням p<0,05 проти контрольної групи. Подібним чином узагальнене оцінювальне рівняння / дисперсійний аналіз (ANOA) використовували для вивчення впливу лікування на об’єм вогнища інфаркту на 28-й день.
Результати
Досліджувані популяції, вихідні характеристики, безпека та смертність
Загалом 115 щурів (n=23 для кожної групи) були рандомізовані до 5 груп лікування. Щурів з оцінками за шкалою Zea-Longa <2 (n=4) або тих, які загинули (n=7) протягом 24 год після оклюзії СМА до будь-яких неврологічних функціональних тестів, виключали з дослідження. В аналіз результатів увійшли дані 104 щурів (табл. 1). Серед них 7 щурів загинули через 2‑3 дні після оклюзії СМА. Рівні смертності між групами були зіставними. Показники маси тіла були збалансовані між групами на вихідному рівні, до оклюзії СМА. Крім того, масу тіла як загальний показник стану та безпеки тварин також реєстрували щотижня, починаючи з 1-го дня після оклюзії СМА. Хоча всі тварини набирали вагу поступово, з часом не було відмінностей у групах за цим показником.
Неврологічний функціональний результат
Через день після оклюзії СМА у всіх щурів виявляли неврологічний функціональний дефіцит подібного ступеня (табл. 2). Із 7-го дня функціональні результати щурів, які отримували Церебролізин®, значно перевершували такі у щурів, яким проводили лікування фізіологічним розчином, у всі контрольні моменти часу (рис. 1). Функціональні показники в щурів, у яких застосовували Когністар®, Церебролізат® або Кортексин®, були зіставними з такими у тварин, яким вводили фізіологічний розчин (без значущої різниці в будь-який контрольний момент часу), і значно гіршими, ніж у тварин, що отримували Церебролізин®.
Об’єм вогнища інфаркту
Оцінений непрямим методом об’єм вогнища інфаркту на 28-й день після оклюзії СМА становив 26,5±2,3% для тварин, що отримували Церебролізин®, 28,5±2,4% – Церебролізат® , 30,8±2,1% – фізіологічний розчин, 33,5±1,9% – Кортексин® і 34,7±2,0% – Когністар®. Критерій Фішера з числом ступенів свободи 4 показав загальний ефект лікування (p<0,0001). Аналіз підгруп продемонстрував, що немає істотної різниці в об’ємах уражень серед тварин, які отримували Кортексин® (p=0,38), Церебролізат® (р=0,45), Когністар® (р=0,19) або Церебролізин® (р=0,14), і тварин, яким вводили фізіологічний розчин. Однак у щурів, які отримували Церебролізин®, були значно менші об’єми вогнищ ураження, ніж при використанні Когністару (на 30%, р=0,004) або Кортексину (на 26%, p=0,018) (рис. 2).
Обговорення
Автори зазначають, що дослідження вперше дозволило порівняти ефективність різних нейропептидних препаратів щодо поліпшення функціонального результату в щурів після інсульту. Дизайн дослідження строго відповідав рекомендаціям, прийнятим під час проведення VIII Академічного круглого столу із проблем лікування інсульту (STAIR-VIII) [46, 47].
Серед досліджуваних препаратів лише Церебролізин® значуще поліпшив функціональний результат порівняно з фізіологічним розчином (див. рис. 1). Ці дані співпадають із результатами клінічних випробувань, в яких оцінювали вплив Церебролізину на функціональне відновлення у поєднанні з реабілітацією [20, 21]. У цих дослідженнях лікування Церебролізином у добовій дозі 30 мл протягом 21 дня поспіль сприяло реабілітації та відновленню моторних функцій. Важливо зазначити, що такі терапевтичні ефекти спостерігалися навіть тоді, коли терапію Церебролізином було розпочато в період тривалістю до 8 днів після виникнення інсульту. Тобто сприятливий вплив Церебролізину на відновлення після інсульту був, очевидно, зумовлений не ранньою нейропротективною дією [20]. Дійсно, в низці експериментальних досліджень було показано, що лікування Церебролізином надійно сприяє множинним процесам ремоделювання мозку, включно з ангіогенезом, нейрогенезом, олігодендрогенезом і аксональним ростом, які є визначальними для неврологічного відновлення після інсульту [48, 49]. Таким чином, Церебролізин® стимулює множинні процеси відновлення/ремоделювання головного мозку, які в сукупності сприяють відновленню після інсульту.
Раніше було продемонстровано, що Церебролізин® у вищій дозі (5 мл/кг) значно знижує об’єм вогнища інфаркту при порівнянні з щурами, яким вводили фізіологічний розчин [28]. Проте автори зазначають, що хоча в даному дослідженні у тварин, які отримували Церебролізин®, спостерігався найменший об’єм вогнища інфаркту серед груп, різниця між групами Церебролізину і фізіологічного розчину не була значущою. Ці та інші попередні результати свідчать про те, що нейропротекторні ефекти Церебролізину можуть бути виразнішими у разі застосування вищих доз та/або якомога більш раннього початку терапії [27, 39]. Незважаючи на це, Церебролізин® значно ефективніше сприяв зменшенню розміру ураження, ніж Когністар® і Кортексин®. До того ж лікування даними пептидними препаратами призвело до тенденції збільшення об’єму ураження порівняно із впливом фізіологічного розчину (рис. 2). Таким чином, немає підстав стверджувати, що пептидні препарати, зокрема Церебролізин®, мали терапевтичний ефект щодо об’єму ураження.
Автори зазначають певні обмеження дослідження. По-перше, принципові відмінності складу й процес виготовлення Церебролізину та інших використаних у цьому дослідженні сполук не розглядали. Наприклад, Когністар® і Кортексин® є ліофілізованими порошками, які потребують перед введенням розчинення у стерильній воді або навіть анальгетиках, таких як новокаїн. Рідкий препарат Церебролізат® містить добавку фенол. По-друге, хоча повідомлялося про подібність інших сполук, таких як Когністар® і Церебролізат® , до Церебролізину щодо різних експериментальних і клінічних проявів, їхні фармакокінетичні/фармакодинамічні характеристики для лікування ішемічного інсульту ще не встановлені. Тому терапевтичні можливості Когністару, Церебролізату та Кортексину щодо відновлення після інсульту потребують подальшого дослідження.
Підсумовуючи, автори констатують: результати проведених досліджень показали, що фармакологічна активність мультипептидних препаратів відрізняється, а очевидні функціональні переваги проти контрольного розчину натрію хлориду продемонстровано тільки для Церебролізину. Тож такі препарати не слід розглядати як взаємозамінювані з погляду ефективності та безпеки при лікуванні інсульту.
Тематичний номер «Неврологія, Психіатрія, Психотерапія» № 1 (48) березень 2019 р.