10 грудня, 2016
Персистенция биопленок Gardnerella vaginalis на вагинальном эпителии после стандартной терапии пероральным метронидазолом
Бактериальный вагиноз (БВ) – наиболее распространенная инфекция репродуктивного тракта у женщин детородного возраста. Помимо дискомфорта, БВ ассоциируется с рядом неблагоприятных акушерских и гинекологических исходов. Как состояние со сниженной колонизационной резистентностью БВ значительно повышает риск инфекций, передающихся половым путем, в частности гонореи, хламидиоза, генитального герпеса и ВИЧ‑1. Кроме того, БВ способствует репликации и вагинальному шеддингу ВИЧ‑1 и HSV‑2, внося вклад в пандемию этих инфекций.
Несмотря на глобальную значимость проблемы БВ, эффективные подходы к лечению этой инфекции ограничены. Стандартные схемы, рекомендованные Центрами по профилактике и лечению заболеваний США (CDC), позволяют достичь излечения только в 60-70% случаев, а у 20-30% женщин в пределах 3 мес после выздоровления наблюдается рецидив. Это объясняется тем, что БВ характеризуется не только избыточным бактериальным ростом, но и присутствием плотной, тесно прикрепленной к слизистой оболочке вагины бактериальной биопленки, которая является облигатным признаком БВ и отсутствует у здоровых женщин.
Бактериальные биопленки ассоциируются с различными резистентными инфекциями (например, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa). Биопленка является значимым механизмом вирулентности, который облегчает прикрепление бактерий к эпителиальным поверхностям, позволяет достигать значительно более высоких концентраций, чем в просветных жидкостях, а также механизмом подавления иммунитета, не позволяющим антимикробным агентам достигать бактерий, вследствие чего последние могут длительно персистировать в биопленке в виде латентных, не размножающихся колоний.
Целью настоящего исследования было изучить эффективность стандартной терапии пероральным метронидазолом в отношении эрадикации БВ‑ассоциированной биопленки, а также персистенции и активности биопленки в период до 5 нед после лечения. Бактерии биопленки визуализировали с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), основанной на 16/23S рибосомальной ДНК (рДНК), при изучении вагинальных биоптатов, которые получали во время терапии и с 1-недельным интервалом после лечения.
Материалы и методы
В исследовании приняли участие 18 женщин с БВ (средний возраст 26,3±5,8 года). Первичный диагноз БВ подтверждали клинически и микробиологически (критерии Amsel и Nugent соответственно). Для включения в исследование у пациентки должны были присутствовать 3 или 4 критерия Amsel (повышенные гомогенные выделения из влагалища, рН >4,5, наличие ключевых клеток при микроскопии и/или «рыбный» запах при добавлении 10% гидрохлорида калия) при оценке Nugent ≥7 для окрашенного по Граму вагинального мазка.
После установления диагноза все женщины получали стандартную пероральную терапию метронидазолом 500 мг 2 р/сут в течение 7 дней. Участниц случайным образом распределили для последующих обследований на 3-й день лечения, на 7-й, 14-й, 21-й, 28-й или 35-й день после лечения (по 3 пациентки в каждой точке времени). При обследовании перед биопсией оценивали статус вагинальной микрофлоры по данным микроскопии висячей капли, по клиническим критериям, микроскопии окрашенного по Граму мазка и с помощью культурального исследования. Затем из латеральной стенки среднего отдела свода получали биоптат (диаметром 1-3 мм) с последующей его фиксацией и получением парафиновых блоков. Микротомные срезы исследовали с помощью FISH с применением различных зондов.
У каждой пациентки оценивали следующие показатели: критерии Amsel и Nugent (статус микрофлоры), бактериальную плотность биопленки (бактериальное число, выраженное в единицах log10), бактериальное разнообразие биопленки (относительное содержание кластеров различных штаммов) и проницаемость биопленки (индикатор активности бактерий).
Результаты
При первичном обследовании все пациентки (n=18) были позитивными по 4 критериям Amsel и имели среднюю оценку Nugent 9 баллов.
После завершения 7-дневного курса лечения у пациенток отсутствовали вагинальные выделения, «рыбный» запах и ключевые клетки на протяжении периода наблюдения, хотя у 9 из 15 женщин (60%) сохранялось умеренное повышение рН (рис. 1А). Отмечен статистически значимый тренд для вагинального рН в динамике наблюдения (р=0,002).
оцениваемые с 1-недельными интервалами после лечения БВ метронидазолом
А. Точки = пациентки; горизонтальные линии – средний вагинальный рН в каждой точке времени; референтная линия на оси Y – пограничное значение рН 4,5. В. Точки = пациентки; горизонтальные линии – средняя оценка Nugent в каждой точке времени; референтные линии на оси Y – пограничные значения оценки Nugent 3 и 7 соответственно. С. Точки = пациентки; горизонтальные линии – среднее бактериальное число в каждой точке времени. D. Точки = пациентки; горизонтальные линии – средняя проницаемость в каждой точке времени; сплошная линия – среднеквадратичный тренд; пунктирные линии – 95% доверительный интервал.
Оценка Nugent после завершения терапии оставалась на уровне <7. В то же время у 7 из 18 пациенток (47%) сохранялась промежуточная флора (оценка Nugent 4-6) без выраженного тренда (рис. 1В) в динамике наблюдения (р=0,422).
Количество бактерий, прикрепленных к вагинальному эпителию, существенно увеличивалось (р≤0,001) со временем (рис. 1С).
Тем не менее наиболее значимым результатом было время-зависимое изменение проницаемости биопленки (р=0,007). Как показано на рисунке 1D, процент окрашенных 6-диамидино‑2-фенилиндолом (DAPI) бактерий в биопленке, связанных с меченными FISH олигонуклеотидными зондами, резко снизился после лечения; средняя проницаемость биопленки составляла 1%. На рисунке 2А показан ограниченный доступ окрашенных DAPI бактерий к Gardnerella-специфическим FISH-зондам во время лечения метронидазолом.
Рис. 2. FISH-микроскопия бактериальной биопленки во время и после лечения метронидазоломА. Бактериальная биопленка (оригинальное увеличение ×400) на 3-й день лечения метронидазолом; обильная, плотно прикрепленная бактериальная биопленка окрашена в голубой цвет, красная флуоресценция соответствует кластерам Gardnerella (зонд GardV-Cy5). Общая проницаемость биопленки для универсального зонда Eub 338 относительно низкая на этой стадии лечения (20%), поэтому только небольшая часть бактерий в биопленке гибридизируется с зондом для G. vaginalis (GardV) как основным компонентом, чего не наблюдается для менее распространенных штаммов, таких как A. vaginae. B. Обильная бактериальная биопленка (оригинальное увеличение ×400) на 35-й день. Бактериальная биопленка полностью восстановилась. Проницаемость биопленки для универсального зонда Eub 338 составляет 90%; наблюдаемые интенсивные флуоресцентные сигналы являются следствием гибридизации бактерий из кластеров Gardnerella и Atopobium как основных компонентов биопленки (зонд Ato-Cy3, связывающийся с Atopobium, – оранжевый цвет; зонд GardV-Cy5, связывающийся с Gardnerella, – красный цвет). Контрокрашивание проведено DAPI (синий цвет).
После лечения проницаемость биопленки прогрессивно увеличивалась (р<0,001) и составила 15% через 2 нед и 90% по окончании наблюдения. На рисунке 2В показаны выраженные слои конгломератов G. vaginalis и A. vaginae на вагинальном эпителии уже через 4 нед после отмены терапии. У всех пациенток основным компонентом биопленки были бактерии, принадлежащие кластеру Gardnerella.
Бактерии кластера Atopobium дали позитивные гибридизационные сигналы у половины пациенток и составили 5-40% бактерий биопленок. Бактерии кластеров Lactobacilli и Bacteroides присутствовали менее чем у половины женщин и составляли незначительную фракцию биопленки (<10%).
Таким образом, на протяжении 3 нед после клинически успешной стандартной терапии БВ у всех обследованных пациенток наблюдалось выраженное накопление БВ-ассоциированных бактерий (Gardnerella и Atopobium) в прикрепленной к вагинальному эпителию биопленке.
Интересно, что все изоляты G. vaginalis были чувствительны к метронидазолу по данным стандартного тестирования методом 50-мкг дисков.
Комментарий
Результаты проведенного исследования свидетельствуют о персистировании нарушений вагинальной экосистемы после эпизода клинически вылеченного БВ. Биопленки аккумулируют большое количество бактерий и включают персистирующие кластеры G. vaginalis и в меньшей степени A. vaginae, недоступные для препарата выбора. Несмотря на относительно непродолжительное время наблюдения, с высокой вероятностью можно предположить, что персистирующая биопленка является причиной рецидивов БВ.
В многочисленных исследованиях установлено, что бактериальные биопленки играют значимую роль при резистентных бактериальных инфекциях (таких как эндокардит, средний отит, периодонтит, хронический простатит и др.) и осложненных хронических состояниях, которые включают воспалительные заболевания кишечника, хроническую обструктивную болезнь легких и муковисцидоз. Биопленка, образованная штаммами G. vaginalis, была впервые обнаружена с помощью электронной микроскопии при БВ в качестве плотной ткани, прочно прилегающей к вагинальному эпителию и состоящей из бактериальных клеток, заключенных внутри сетки из полисахаридных волокон. Позднее, в процессе проведения вагинальной биопсии методом флуоресцентной гибридизации in situ бактериальных рДНК, мы предположили, что наличие биопленки играло главную роль в развитии БВ.
Биопленка объясняет так называемый парадокс метронидазола при лечении БВ, состоящий в несоответствии высокой чувствительности штаммов Gardnerella in vitro и низкой клинической эффективности лечения. Например, в исследовании Beigi и соавт. чувствительность анаэробных вагинальных культур к метронидазолу, определяемая через 3 мес после завершения лечения, составила >99%, что резко контрастирует с частотой клинического излечения при использовании этого препарата. Повышение дозы и/или длительности терапии метронидазолом для преодоления персистенции G. vaginalis не является адекватной опцией, поскольку повышенные дозы препарата значительно подавляют индигенные лактобациллы, а, как известно, сохранение и восстановление вагинальных лактобацилл является критическим для выздоровления при БВ в ходе лечения стандартной дозой метронидазола.
Результаты настоящего исследования свидетельствуют о целесообразности изменения диагностики БВ, поскольку наличие биопленки как активного резервуара G. vaginalis не всегда сопровождается традиционными индикаторами нарушенной микрофлоры влагалища. Кроме того, очевидна необходимость пересмотра стандартов лечения БВ с заменой метронидазола другими, более эффективными препаратами или комбинациями.
Список литературы находится в редакции.
Статья печатается в сокращении.
Swidsinski A., Mendling W., Loening-Baucke V. et al. An adherent Gardnerella vaginalis biofilm persists on the vaginal epithelium after standard therapy with oral metronidazole. American Journal of Obstetrics & Gynecology 2008; 198 (1): 97.e1-6.