Інтеграція вірусу гепатиту В у геном сперматозоїдів: клінічні ризики з позицій репродуктології

Кількість людей, які страждають і помирають від вірусного гепатиту В (ВГВ), можна порівняти з кількістю хворих на коронавірусну хворобу 2019 року (COVID‑19), яка наразі викликає велике занепокоєння в усьому світі. Тому вкрай важливим залишається питання передачі вірусу, у тому числі через статеві клітини. Попередніми дослідженнями встановлено, що гени ВГВ, інтегровані в людські сперматозоїди, здатні до реплікації та експресії після передачі ембріонам. Однак досі це явище не було підтверджено клінічними дослідженнями у пацієнтів. Автори вивчали особливості інтеграції ВГВ у геном сперматозоїдів пацієнтів та аналізували можливі клінічні наслідки для потомства.

Ключові слова: вірусний гепатит В, гени вірусного гепатиту В, інтеграція ДНК вірусного гепатиту В.

Гепатит В – це інфекційне захворювання, спричинене ВГВ, який вражає печінку й може проявлятися як гострим, так і хронічним процесом. За оцінками Всесвітньої організації охорони здоров’я, у 2019 році нараховувалося 296 млн осіб із хронічною формою гепатиту В, при цьому щороку реєструється 1,5 млн нових випадків інфікування [1]. У 2019 році гепатит В призвів до 820 тис. смертей, переважно від цирозу та гепатоцелюлярної карциноми (первинного раку печінки) [1].

Продовження людського життя і роду відбувається через розмноження, а найбільш важливими аспектами репродукції є запліднення та успішний розвиток ембріона. Тому вплив ВГВ-інфекції на статеві клітини людини та оцінка можливих клінічних наслідків привертає все більшу увагу науковців.

У 1985 році за допомогою молекулярної ­гібридизації Hadchou et al. виявили інтегровані послідовності ДНК ВГВ у сперматозоїдах двох із трьох пацієнтів із гострим гепатитом В [2]. У 2002 році Huang et al. за допомогою флуоресцентної гібридизації in situ (FISH) виявили специфічні флуоресцентні сигнальні плями ДНК ВГВ у хромосомах сперматозоїдів одного з дев’яти пацієнтів із хронічним персистуючим ВГВ, що вказує на здатність вірусу інтегруватися у хромосоми сперматозоїдів людини [3]. Попередні експериментальні дослідження показали, що гени ВГВ, інтегровані в сперматозоїди, здатні до реплікації та експресії після введення в ембріони під час запліднення [4-6]. Однак на сьогодні це явище не було підтверджено в клінічних випробуваннях у пацієнтів.

У цьому дослідженні об’єктом для вивчення були чоловіки, хворі на гепатит В, партнерші яких були здоровими. Метою дослідження було вивчення інтеграції ­генів ВГВ у геном сперматозоїдів пацієнтів та подальше запліднення яйцеклітин сперматозоїдами, що містять інтегровані гени ВГВ. Крім того, вивчалася реплікація та експресія вірусних генів в ембріонах з оцінкою потенційних клінічних ризиків і наслідків.

Матеріали та методи

Учасники дослідження підписали інформовану згоду щодо використання зразків їхньої сперми та ембріонів (відбракованих через непридатність для перенесення або кріоконсервації під час допоміжних репро­дуктивних технологій [ДРТ]) для дослідницьких цілей, а також на публікацію результатів дослідження.

З червня 2020 року по жовтень 2021 року 48 пацієнтів чоловічої статі з діагнозом хронічного гепатиту В за результатами комбінованого аналізу (антиген/антитіло), а також їхні дружини, серонегативні на ВГВ, були відібрані з числа пар, які проходили процедуру ДРТ у Жіночій та дитячій лікарні м. Сичуань «Цзіньсінь Сінань» (КНР). Пацієнти були розподілені на дві групи залежно від наявності або відсутності інтеграції ДНК ВГВ у геном рухливих сперматозоїдів. До першої групи увійшли 23 пацієнти, середній вік яких становив 33,5 (діапазон: 26-43) року, без наявності вірус­ної ДНК у геномі сперматозоїдів. Другу групу склали 25 пацієнтів, середній вік яких становив 32,9 (діапазон 26-44) року, з інтегрованою у геном сперматозоїдів ДНК ВГВ. Крім того, 48 здорових чоловіків-­донорів сперми, середній вік яких становив 32,1 (діапазон: 23-48) року, були включені до контрольної групи.

Результати

Вірусне навантаження та інтеграція ДНК ВГВ у геном сперматозоїдів

Середня кількість копій ДНК ВГВ на 1 мл сироватки крові становила 1,74Ч10⁴ та 1,39Ч10⁴ у 1‑й та 2‑й групі відповідно, при цьому різниця не була статистично значущою (p>0,05). У 2‑й групі середня кількість копій ДНК ВГВ на 1 мл рухливих сперматозоїдів становила 1,18Ч10³, що було значно нижче, ніж у сироватці крові (p<0,01).

У пацієнтів 2‑ї групи спостерігалася інтеграція ДНК ВГВ у геном як рухливих, так і нерухливих сперматозоїдів, тоді як у пацієнтів 1‑ї групи вірусної ДНК у геномі сперматозоїдів виявлено не було (рисунок). Рівень інтеграції склав 0,109±0,018%, що свідчило про сильну кореляцію з кількістю копій ДНК ВГВ у рухливих сперматозоїдах (r=0,544, p<0,01).

Рис. Виявлення інтеграції ДНК ВГВ у геном сперматозоїдів за допомогою методу FISH: А — позитивний сигнал (яскраво-­зелений) ДНК ВГВ, виявлений у геномі рухливих сперматозоїдів пацієнта 2‑ї групи (стрілка); В — позитивний сигнал (яскраво-­зелений) ДНК ВГВ, виявлений у геномі нерухливих сперматозоїдів пацієнта 2‑ї групи (стрілка)

Дослідження показало, що рівень інтеграції ДНК ВГВ у нерухливих сперматозоїдах (0,198±0,037%) був значно вищим, ніж у рухливих (0,102±0,017%) (р<0,05). Це вказує на те, що інтеграція ДНК ВГВ може впливати на рухливість сперматозоїдів.

Вплив ВГВ на якість сперми та фертильність

У цьому дослідженні не було виявлено статистично значущої різниці у віці та показниках спермограми у пацієнтів контрольної та 1‑ї груп (p>0,05). Однак концентрація сперматозоїдів, загальна й прогресивна рухливість, життєздатність і рівень фертильності у 2‑й групі були значно нижчими, ніж у контрольній (p<0,01) (­таблиця). При цьому індекс фрагментації ДНК сперматозоїдів (DFI) у пацієнтів 2‑ї групи був значно вищим, ніж у контрольній групі (p<0,01).

Реплікація та експресія інтегрованих генів ВГВ в ембріонах людини, отриманих зі сперматозоїдів пацієнтів

У даному дослідженні 2‑га група була розділена на три підгрупи: A, B і C, кожна з яких складалася з восьми або дев’яти пацієнтів. У підгрупі А ембріони, отримані зі сперматозоїдів пацієнтів, були використані для оцінки інтеграції (група А1) та реплікації (група А2) генів ВГВ. У підгрупах В і С ембріони були використані для оцінки транскрипції і трансляції генів ВГВ. У якості контролю використовували ембріони, отримані зі сперматозоїдів пацієнтів 1‑ї групи.

При проведенні FISH-аналізу були виявлені послідовності генів S, C, X і P ВГВ у геномах ембріонів, отриманих від сперматозоїдів підгрупи A1, тоді як у контрольній групі не було виявлено жодного з них. Ці дані свідчать про те, що гени ВГВ були інтегровані в ембріони під час запліднення. Ступінь інтеграції становив 28,57% для S, 42,86% – для C, 44,44% – для X і 22,22% – для P протеїну. У підгрупі A2 позитивні результати на наявність специфічних білків спостерігалися в геномах різних бластомерів досліджуваного ембріона, що вказує на реплікацію генів ВГВ в ембріонах. Рівень реплікації склав 14,29% для S, 14,29% – для C, 22,22% – для X і 11,11% – для P, що було нижче, ніж ступінь інтеграції.

За допомогою полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі та імунофлуоресцентного аналізу було встановлено, що гени S, C, P і X гепатиту В були транскрибовані й трансльовані в ембріонах, отриманих від сперматозоїдів з інтегрованою в них вірусною ДНК.

Обговорення

Вірусне навантаження та інтеграція ДНК ВГВ у геном сперматозоїдів пацієнтів

Сперма складається з різних компонентів, включаючи сім’яну рідину, рухливі й нерухливі сперматозоїди, епітеліальні клітини, лейкоцити, незрілі статеві клітини та ізольовані головки або хвости сперматозоїдів [8]. Ключовим моментом у репродукції людини є запліднення, яке досягається шляхом злиття яйцеклітини з рухливим сперматозоїдом, тому дане дослідження було зосереджене саме на цих клітинах. У 2‑й групі середня кількість копій ДНК ВГВ у рухливих сперматозоїдах була значно нижчою, ніж у сироватці крові, що, ймовірно, зумовлено гематоенцефалічним бар’єром, який певною мірою обмежує потрапляння ВГВ із крові у сперматозоїди.

Авторами дослідженні вперше було визначено рівень інтеграції ДНК ВГВ у геном рухливих сперматозоїдів та підтверджено його тісну кореляцію з кількістю вірусних копій у цих клітинах.

Слід зазначити, що в цьому дослідженні інтеграція ДНК ВГВ у геном сперматозоїдів спостерігалася не у всіх інфікованих ВГВ пацієнтів, а лише у 25 із 48. Враховуючи той факт, що найвищий показник інтеграції ДНК ВГВ у геном рухливих сперматозоїдів становив 0,158%, стає зрозумілим, що цей процес не поширився на всі сперматозоїди одного пацієнта.

Вплив ВГВ на якість сперми та фертильність

У цьому дослідженні у 2‑й групі пацієнтів (з інтегрованою у геном сперматозоїдів ДНК ВГВ) спостерігалися відхилення в концентрації, загальній та прогресивній рухливості, життєздатності сперматозоїдів, DFI та рівні фертильності порівняно з контрольною групою.

Було запропоновано кілька потенційних механізмів для пояснення того, як ВГВ впливає на якість сперми та фертильність. По-перше, білок ВГВ S (HBs) може викликати окисний стрес, що призводить до зниження мембранного потенціалу мітохондрій і виснаження енергії, необхідної для руху сперматозоїдів. Окисний стрес також може порушувати цілісність мембрани, яка має вирішальне значення для підтримання рухливості сперматозоїдів, їхньої здатності до накопичення енергії, акросомальної реакції та взаємодії з яйцеклітинами. Крім того, це може призводити до накопичення невиправлених пошкоджень ДНК [12, 13]. По-друге, ВГВ може викликати дисфункцію сперматозоїдів, запускаючи процес апоптозу мітохондрій [10, 14]. Це, у свою чергу, може знижувати здатність сперматозоїдів до запліднення. По-третє, інтеграція ДНК ВГВ може впливати на рухливість сперматозоїдів, що є ключовим фактором у процесі запліднення, а також індукувати хромосомні аномалії сперматозоїдів [3]. Ці механізми в кінцевому підсумку призводять до зниження якості сперми та здатності до запліднення у пацієнтів, інфікованих ВГВ.

Реплікація та експресія інтегрованих генів ВГВ в ембріонах людини, отриманих від сперматозоїдів пацієнтів із ВГВ

У попередніх еспериментальних дослідженнях було виявлено, що гени ВГВ, інтегровані в геном сперматозоїдів, мають здатність до реплікації та експресії в ембріоні [4-6, 17]. Хоча ці висновки мають важливе значення, через суттєві відмінності в анатомічних і метаболічних характеристиках результати, отримані на експериментальних моделях тварин, можуть не зовсім точно відображати реальні умови в організмі людини.

Тому існувала потреба в подальшому вивченні цього питання, але з використанням клінічних зразків. Результати даного дослідження показали, що інтегровані в сперматозоїди гени ВГВ S, C, X  і P можуть бути введені в ембріони під час запліднення, а також що вони зберігають свої функції реплікації, транскрипції та трансляції в ембріонах. На додаток до цього було визначено кілька важливих питань, які потребують подальшого вивчення.

Згідно з теоретичними очікуваннями, коли ооцит запліднюється сперматозоїдом, що містить інтегрований ген ВГВ, останній має реплікуватися разом із геномом господаря, у результаті чого кожна клітина ембріона містить послідовності ВГВ. Однак у цьому дослідженні лише частина бластомерів в одній бластоцисті містила у своєму геномі послідовності ВГВ. Крім того, було виявлено, що швидкість реплікації генів S, C, X і P ВГВ була нижчою, ніж швидкість їх інтеграції. Зіставлення цих даних вказує на те, що ген ВГВ не реплікується в деяких ембріональних клітинах і більше не присутній в їхніх дочірніх клітинних лініях. Причини цього явища залишаються нез’ясованими.

Слід зазначити, що останнім часом здатність людських ембріонів до самокорекції привертає значну увагу спеціалістів із репродуктивної біології. Повідомлялося, що людські ембріони мають здатність усувати або елімінувати аномальні бластомери у вигляді залишків або фрагментів клітин [18]. З огляду на вищезгадані результати варто дослідити, чи існують у людських ембріонах механізми самокорекції, які перешкоджають реплікації вірусних генів або усувають клітини, що містять такі гени.

Потенційний клінічний ризик інтеграції гена ВГВ у геном сперматозоїдів

Згідно з класичною теорією, передача ВГВ відбувається через інфекційні віріони, також відомі як тільця Дейна. Віріони прикріплюються до поверхневих рецепторів гепатоцитів і мігрують до ядра. Згодом, завдяки процесам складання вірусного капсиду, формуються нові віріони, продовжується інфікування інших клітин [15]. Однак у даному дослідженні гени ВГВ спочатку були інтегровані в геном сперматозоїдів пацієнтів, а потім уведені в ембріони шляхом запліднення. Ці інтегровані гени зберігалися в ембріоні шляхом напівконсервативної реплікації, не втрачаючи здатність до транскрипції та трансляції, що потенційно призводило до інфікування потомства, отриманого від цих ембріонів. Цей спосіб передачі ВГВ, що передбачає інтеграцію генів, а не віріонів, являє собою принципово інший механізм, ніж звичайний спосіб передачі, описаний вище.

Слід зазначити, що введені та інтегровані в ембріон послідовності вірусних генів можуть зберігатися в геномі господаря шляхом напівконсервативної реплікації навіть протягом усього життя. У цьому дослідженні було доведено, що інтегрований ген S здатний експресувати HBsAg в ембріоні. Упродовж періоду розвитку та дозрівання імунної системи ембріону HBsAg, трансльований з інтегрованого гена S, потенційно здатний викликати імунну відповідь організму, таким чином спричиняючи гепатит. Також не виключений потенційний ризик канцерогенезу впродовж тривалого періоду розвитку від ембріона до дорослого віку.

Нарешті, інтеграція ДНК ВГВ може призводити до нестабільності геному сперматозоїдів і збільшення фрагментації їхніх ДНК, що спричиняє хромосомні аномалії [3]. При заплідненні нормальними яйцеклітинами ці сперматозоїди становлять потенційний ризик для ембріонів, включаючи переривання вагітності, викидень і мертвонародження.

Клінічне значення результатів дослідження

Отримані результати підтвердили гіпотезу, згідно з якою ВГВ поширюється шляхом інтеграції вірусних генів у сперматозоїди людини, а не шляхом передачі вірусу через віріо­ни. Це дає теоретичні та експериментальні підстави для подальших досліджень щодо профілактичних заходів для запобігання поширенню вірусу та збереження здоров’я людини.

Дослідження показало, що інтеграція генів вірусу в сперматозоїди відбувається не у всіх пацієнтів із гепатитом В. Тому для народження здорового потомства вкрай важливо перевірити, чи існує інтеграція генів ВГВ у сперматозоїди. За негативних результатів тесту можна впевнено розраховувати на народження здорових дітей. У хворих із позитивними результатами також існує можливість мати здорове потомство, оскільки не всі сперматозоїди з одного еякуляту несуть інтегровані вірусні гени. Однак наразі не існує методу селективного відбору здорових сперматозоїдів у таких пацієнтів для запліднення, і це може бути досягнуто лише за умови розвитку відповідних технологій.

Реферативний огляд підготувала Марія Ареф’єва

За матеріалами: Han T.-T., Huang J.-H., Li L.-X. et al. Integration of hepatitis B virus into patients’ sperm genome and its clinical risks. Andrology. 2024; 1-12.

Тематичний номер «Урологія. Нефрологія. Андрологія» № 1 (32), 2024 р.