29 грудня, 2021
Льодяники для лікування горла з фіксованою комбінацією цетилпіридинію хлориду та бензидаміну гідрохлориду чинять пряму віруліцидну дію на SARS-CoV-2
Інфекції респіраторного тракту (ІРТ) належать до найпоширеніших захворювань і мають типові симптоми, як-от риніт, кашель, підвищена температура тіла та біль у горлі. Серед мікробів найчастішими збудниками запалення в порожнині рота та горла є віруси. Бактеріальні ІРТ трапляються рідше, й часто розвиваються після вірусної інфекції. Найпоширенішими вірусами, пов’язаними з розвитком ІРТ, є пікорнавіруси (риновіруси людини), коронавіруси (загальний коронавірус людини (hCoV) OC43, 229E, NL63, HKU1), орто- та параміксовіруси (грипу, парагрипу та респіраторно-синцитіальний вірус), респіраторні аденовіруси й інші [1].
Багато патогенних вірусів, що циркулюють, покриті подвійним ліпідним шаром та інфікують клітини-мішені, індукуючи злиття вірусної оболонки з клітинною мембраною. Чимало класів вірусів, які мають оболонку, є патогенами для людини, включаючи респіраторні віруси, зокрема віруси грипу (чотири роди в сімействі Orthomyxoviridae: грип A, B, C і D), респіраторно-синцитіальний вірус (сімейство Pneumoviridae), коронавіруси (сімейство Coronaviridae) тощо [2].
Коронавіруси людини є циркулювальними вірусами, які вважаються другими за поширеністю збудниками, відповідальними за 10-15% усіх інфекцій верхніх дихальних шляхів (ІВДХ) у людей [3]. Вони розмножуються в носоглотці та переважно спричиняють легкі ІВДХ, що минають без лікування з короткими інкубаційними періодами, хоча іноді розвиваються респіраторні інфекції нижніх відділів дихальних шляхів і пневмонія [4].
Після виникнення більш вірулентних коронавірусів, як-от SARS-CoV‑1 у 2002 р. і MERS-CoV у 2012 р., було встановлено, що коронавіруси також можуть зумовлювати тяжкі пневмонії з тривалішим періодом інкубації та часто летальним результатом [5]. Наприкінці 2019 р. коронавірусна хвороба (COVID‑19), спричинена новим коронавірусом SARS-CoV‑2, призвела до глобальної пандемії, через яку було інфіковано понад 144 млн осіб і померли понад 3 млн осіб у всьому світі [6]. Симптоми COVID‑19 можуть варіювати від відсутності симптомів до підвищення температури, кашлю й тяжкого перебігу з утрудненим диханням. Окрім того, захворювання може зумовлювати серйозні розлади здоров’я та навіть смерть [7, 8].
Респіраторні віруси переважно передаються повітряно-крапельним шляхом під час видиху у вигляді дрібних крапель, але було доведено, що інфекція поширюється непрямим контактом із зараженими контамінованими вірусом поверхнями. Зниження вірусного навантаження у вогнищі інфекції знижує ризик передачі обома способами й одночасно зменшує симптоми в пацієнтів і потенційне поширення інфекції на нижні дихальні шляхи [1].
Цетилпіридинію хлорид (ЦПХ), четвертинна амонієва сполука, є антисептиком, дія й застосування котрого є типовими для катіонних поверхнево-активних речовин (сурфактантів). Окрім емульгулювальних і мийних властивостей, четвертинні амонієві сполуки мають також бактерицидну дію щодо грампозитивних бактерій, а у високих концентраціях – і щодо деяких грамнегативних бактерій. Вони також чинять змінну протигрибкову дію та є ефективними стосовно деяких вірусів [9, 10]. Про їхні віруліцидні активності широко не повідомляється, але в літературі з дезінфекції поверхонь згадуються деякі дані про їхню ефективність щодо вірусів, які мають оболонку [11]. У цій групі сполук недавно було показано, що ЦПХ активний стосовно вірусів грипу in vitro й in vivo за допомогою прямого впливу на вірусну оболонку з EC50 in vitro 5-20 мкг/мл [12]. ЦПХ зазвичай використовується в лікарських ополіскувачах для порожнини рота, льодяниках для лікування горла та спреях.
У цьому дослідженні вивчалася віруліцидна активність ЦПХ in vitro у вигляді вільної активної речовини, комбінації бензидаміну гідрохлориду (БГ) і ЦПХ у вигляді вільної активної речовини та комбінації БГ і ЦПХ у вигляді льодяників для лікування горла.
За нашими даними, це перше дослідження, в якому вивчається віруліцидний ефект льодяників, що містять фіксовану комбінацію БГ і ЦПХ, на вірус SARS-CoV‑2.
Матеріали та методи
Підготовка клітин
Семиденні клітини Vero E6 (засів 13-16) були трипсинізовані та ресуспендовані в мінімальному необхідному середовищі Дульбекко – DMEM (Thermo Fisher Scien-tific, Waltham, MA) з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки – ФБС (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), щоб отримати кінцеву концентрацію 1×105 клітин/мл. У кожну ямку 96-ямкового планшета для культивування клітин переносять усього 100 мкл приготовленої клітинної суспензії й інкубують протягом ночі за температури 37 °C і 5% CO2 для досягнення 80% злиття клітин, потрібного для кількісних тестів суспензії.
Виділення та кількісний аналіз вірусу
SARS-CoV‑2 був виділений із мазка з горла пацієнта з діагнозом COVID‑19, у клітинах Vero E6, культивований із DMEM і доповнений 10% ФБС. Вірус був пасерований 5 разів на Vero E6, розділений на аліквоти та збережений за температури -80 °C до подальшого використання.
Концентрація вірусу була визначена за допомогою аналізу кінцевого розведення й виражена як доза, що інфікує 50% клітин культури тканини/мл (TCID50/мл), розрахована за методом Спірмена та Кербера. Вихідна концентрація, використана в усіх випробуваннях, становила 1,17×109 TCID50/мл.
Приготування реагентів
Усі препарати, використані в наших випробуваннях, були надані компанією «КРКА, д. д.», Ново-Место, Словенія, тоді як інші використані реагенти були приготовлені в Інституті мікробіології й імунології (м. Любляна, Словенія). Інтерферувальну речовину було отримано шляхом розчинення 3 г бичачого альбуміну в 97 мл води. Потім 97 мл приготованого та відфільтрованого розчину бичачого альбуміну змішували з 3 мл еритроцитів барана (BioSap SEA, BioGnost) для того, щоб отримати остаточну форму інтерферувальної речовини, що використовується в наших експериментах. Жорстка вода була свіжоприготовлена в асептичних умовах у день проведення випробування відповідно до SIST EN14476:2013 + A2:2019 «Хімічні дезінфікувальні й антисептичні засоби: кількісний тест суспензії для оцінки віруліцидної активності в медичній галузі» (стандарт) і була використана протягом 12 год [13].
Для кожної активної субстанції було приготовлено три різні концентрації шляхом розчинення випробуваної субстанції в 4 мл (висока концентрація), 20 мл (середня концентрація) або 30 мл (низька концентрація) жорсткої води. Усі склади активної субстанції й експериментальні умови представлено в таблиці 1.
Кількісний тест суспензії для оцінки віруліцидної активності
Щоб імітувати фізико-хімічні властивості ротової порожнини людини, враховувалися кілька чинників, як-от температура, склад слини (інтерферувальна речовина) та кількість слини, що утворюється при розчиненні льодяників, динаміка розчинення льодяників (різний час контакту вірусу з речовиною). Методика експерименту відповідала стандартним вимогам. Активну речовину спочатку розчиняли в жорсткій воді, потім додавали до суспензії вірусу SARS-CoV‑2 й інтерферувальної речовини у співвідношенні 1:10. Суміш витримували за температури 37 ºC протягом різних періодів інкубації (1, 5 і 15 хв). Наприкінці кожного часу експозиції аліквоту інкубованої суспензії розбавляли в крижаному підтримувальному середовищі DMEM із 2% ФБС для негайного пригнічення віруліцидної дії використовуваної активної субстанції. Приготовлені розведення (від 1:10 до 1:108) вихідної суспензії вірусу були перенесені на моношар клітин Vero E6 у 96-ямкових мікротитрувальних планшетах й інкубовані протягом 7 днів за 37 ºC і 5% CO2. Після інкубації планшети перевіряли на цитопатогенний ефект і обчислювали вірусні титри методом Спірмена та Кербера [14].
Тест на титрування вірусу для кожної використовуваної аліквоти SARS-CoV‑2 проводився відразу після відтавання та ще через 15 хв, щоб оцінити вплив відтавання на концентрацію вірусу й визначити точні робочі концентрації вірусу для кожного експерименту.
Контрольні експерименти
Крім експериментів для оцінки віруліцидної дії активної речовини на вірус SARS-CoV‑2, проводилися також контрольні експерименти відповідно до стандарту.
Кожен експеримент включав необроблені клітини, що служили як негативний контроль і надавали інформацію про життєздатність клітин протягом усього періоду інкубації.
Вивчення життєздатності вірусу проводилося для кожного кількісного тесту суспензії для того, щоб оцінити стабільність вірусу в підтримувальному середовищі та його інфікувальну здатність в експериментальних умовах протягом усього часу контакту. Суміш 0,1 мл вірусної суспензії, 0,1 мл інтерферувальної речовини й 0,8 мл жорсткої води інкубували за температури 37 ºC протягом 15 хв. Зразок об’ємом 0,1 мл був відібраний на початку та через 15 хв інкубації. Десятиразові серійні розведення були приготовлені в мінімальному есенціальному середовищі Голка, модифікованому за способом Дульбекко (DMEM) із додаванням 1% ФБС, і по 100 мкл приготовлених серійних розведень було додано в кожну ямку у восьми повторностях.
Щоб уникнути хибнопозитивних результатів через морфологічні зміни, зумовлені цитотоксичною дією активної речовини на клітини Vero E6 в експериментальних умовах, була визначена найвища концентрація випробуваної субстанції, яка не спричиняє видимих морфологічних змін у клітинах. Десятиразові розведення випробуваної субстанції були приготовлені в підтримувальному середовищі, потім 100 мкл кожного розведення перенесені в моношар клітини у восьми повторностях. Клітини інкубували протягом 48 год і перевіряли на будь-які морфологічні зміни.
Одночасно визначали інгібувальний ефект крижаного середовища на віруліцидну активність випробуваного препарату. Була приготовлена суспензія з 0,1 мл інтерферувальної речовини, 0,1 мл підтримувального середовища та 0,8 мл випробуваного препарату. Потім 0,1 мл приготовленої суміші було перенесено в 0,8 мл крижаного підтримувального середовища та розміщено на 4 ºC. Далі 0,1 мл вірусної суспензії було додано до крижаної суспензії й інкубовано на льоду протягом 15 хв. Після інкубації були приготовлені серійні розведення й перенесені на культури клітин у восьми повторностях.
Щоб визначити вплив максимальної нецитотоксичної концентрації активної речовини на чутливість клітини до вірусу, приготували десятиразові розведення випробуваної субстанції в підтримувальному середовищі, видалили живильне середовище й додали 100 мкл приготованого розчину активної речовини на моношарах клітин у восьми повторностях. Після 1 год інкубації при 37 ºC і 5% CO2 видаляли супернатанти, промивали клітини підтримувальним середовищем й інокулювали з приготованими десятиразовими серійними розведеннями SARS-CoV‑2.
Усі контрольні експерименти проводилися одночасно та в тих самих умовах, що й кількісні випробування суспензії.
Електронна мікроскопія
За допомогою електронної мікроскопії додатково оцінювали вплив ЦПХ у вигляді вільної активної речовини та комбінації БГ/ЦПХ у вигляді льодяників на морфологію вірусу. Частки вірусу були візуалізовані під трансмісійним електронним мікроскопом після контакту з ЦПХ і БГ/ЦПХ у вигляді льодяників у висококонцентрованих суспензіях. Приготували 800 мкл суспензії випробуваного препарату (або підтримувального середовища для негативного контролю) й додавали 100 мкл інтерферувальної речовини та 100 мкл суспензії вірусу. Після 15 хв впливу при 37 ºC приготували зразки для електронної мікроскопії. Сітки для електронної мікроскопії (мідні сітки з 400 ланками, покриті Формваром і на вуглецевій основі) були приготовлені за допомогою ультрацентрифугування в системі Airfuge. Підготовлені сітки з концентрованими вірусними частками негативно контрастували з 2% фосфорновольфрамовою кислотою та досліджували під трансмісійним електронним мікроскопом при збільшенні від 30 000 до 100 000 разів.
Статистичний аналіз
Для оцінки впливу активних речовин на концентрацію й інфікувальну здатність SARS-CoV‑2 порівнювали розраховані концентрації вірусу після всіх трьох періодів інкубації з різними активними субстанціями з використанням незалежного t-тесту в програмному інструменті SPSS Statistics V26.
Результати
Результати контрольних процедур
Контроль клітин і вірусів
Контроль клітин і вірусів проводився постійно для кожного тесту. Всі результати контролю відповідали критеріям.
Контроль вірусу протягом усього часу контакту в ході тесту
Випробувану суспензію вірусу інкубували протягом 15 хв, що являє собою загальний час інкубації в методиці дослідження. Виконували її паралельно з кожним віруліцидним тестом. У спостережуваний період часу значного зниження концентрації інфекційного вірусу не відзначалося. У процесі тестування низької концентрації комбінації БГ і ЦПХ у вигляді вільної активної речовини та льодяників плацебо було досягнуто критичне зниження концентрації інфекційних вірусів (значення 1 логарифмічного рівня). Отримані результати представлено в таблиці 2.
Пригнічення активності випробуваного препарату в крижаному середовищі
Тест було проведено для високої концентрації випробуваного препарату. Отримані результати представлено в таблиці 3. Було продемонстровано інгібувальний вплив крижаного середовища на дію випробуваного препарату, який використовується у високій концентрації, щодо інфікувальної здатності вірусу. Титр вірусу до та після впливу істотно не відрізнявся й не наближався до різниці в 1-log значення концентрації, заданого як граничне значення згідно зі стандартними рекомендаціями.
Контроль втручання – контроль сприйнятливості клітин
Контроль втручання проводили двома окремими процедурами: спочатку для ЦПХ у вигляді вільної активної речовини та льодяників у комбінації БГ/ЦПХ, а потім для БГ/ЦПХ у вигляді вільної активної речовини та льодяників плацебо. Концентрація вірусу в заражених клітинах була трохи нижче, ніж у незаражених. Проте різниця все ще була прийнятною й не перевищувала 1-log. Результати показали, що випробовувані препарати не мали значного впливу на сприйнятливість клітин до вірусної інфекції.
Цитотоксичний ефект
Тестували розведення від 10-1 до 10-11 вихідної концентрації та цитотоксичний ефект (деформація клітин і руйнування моношару клітин) відзначався в розведеннях 10-1 і 10-2. Ефект поширення вірусу перевіряли тільки в клітинах, інокульованих із розведенням випробуваного розчину від 10-3 до 10-11. Дані спостереження розглядалися при інтерпретації результатів (цитотоксичний рівень). Рівень цитотоксичності щодо розведення вірусу становив 4,5 log10 (с) (TCID50/мл) для нерозведеної комбінації БГ/ЦПХ у вигляді вільної активної речовини, льодяника БГ/ЦПХ і льодяника плацебо. Для всіх інших випробуваних препаратів у середній і низькій концентраціях і ЦПХ у вигляді вільної активної речовини у високій концентрації рівень цитотоксичності становив 3,5 log10 (c) (TCID50/мл).
Результати ефективності випробуваного препарату на інактивацію вірусу
Вірус піддавався впливу кожної з трьох концентрацій випробуваної субстанції протягом часу експозиції 1, 5 і 15 хв. Кожен тест проводився у двох паралельних аналізах (його повторювали) в різні дні. Графічні результати експозиції SARS-CoV‑2 суспензії випробуваного препарату у високій концентрації та протягом тривалого часу впливу, представлені на рисунку 1, відображають віруліцидні ефекти певного випробуваного препарату. Чисельні результати та зниження представлені як середнє значення обох тестів у таблиці 4.
Рис. 1. Експозиція SARS-CoV-2 суспензії випробуваного препарату у високій концентрації та час контакту
Вплив випробуваного препарату у високій концентрації
Вільна активна речовина: ЦПХ продемонстрував середнє log10 зниження вірусного титру на 0,00±1,06 через 1 хв, 1,88±0,96 через 5 хв та 4,94±0,75 через 15 хв дії. БГ/ЦПХ продемонстрували середнє log10 зниження на 1,57±0,86; ≥4,49±0,67 та ≥4,49±0,67 через 1, 5 і 15 хв впливу відповідно.
Льодяники: комбінація БГ/ЦПХ продемонструвала середнє log10 зниження вірусного титру на 4,32±0,82 вже на першій хвилині дії; через 5 і 15 хв впливу зниження становило ≥4,44±0,75.
Згідно з очікуваннями льодяник плацебо продемонстрував значно менші зниження. На першій хвилині впливу відзначалося збільшення вірусного титру зі значеннями 0,25±1,01, потім зниження на 2,00±0,92 та 2,88±0,83 через 5 і 15 хв відповідно. Негативний контроль не виявив жодних негативних впливів на вірусний титр.
Вплив випробуваних препаратів у середній концентрації
Вільна активна речовина: ЦПХ у вигляді вільної активної речовини продемонстрував середнє log10 зниження на 0,06±0,99; 0,75±0,98 та 2,44±0,79 через 1, 5 і 15 хв впливу відповідно. Значення БГ/ЦПХ становили 1,96±0,95; 3,30±0,96 та 5,63±0,77 через 1, 5 і 15 хв впливу відповідно.
Льодяники: комбінація БГ/ЦПХ продемонструвала середнє log10 зниження на 1,69±0,96; 3,56±0,86 та 5,00±0,68 через 1, 5 і 15 хв впливу відповідно. Льодяник плацебо продемонструвала зниження на 0,81±0,92; 1,06±0,98 та 0,65±1,05 через 1, 5 і 15 хв впливу відповідно. Негативний контроль не виявив жодних негативних впливів на вірусний титр.
Вплив випробуваних препаратів у низькій концентрації
Вільна активна речовина: ЦПХ продемонстрував log10 зниження на 0,32±1,08; 0,70±1,04 та 1,69±1,03 через 1, 5 і 15 хв впливу відповідно. На тлі комбінації БГ/ЦПХ зниження становило 0,89±1,03; 1,58±0,98 та 2,44±0,94.
Льодяники: комбінація БГ/ЦПХ продемонструвала середнє log10 зниження на 0,88±1,11; 1,19±1,03 та 3,01±1,05 через 1, 5 і 15 хв впливу відповідно. Льодяник плацебо продемонстрував підвищення вірусного титру на 0,13±1,06 на першій хвилині впливу, потім зниження на 0,46±0,98 та 1,46±0,97 через 5 і 15 хв впливу відповідно. Негативний контроль не виявив жодних негативних впливів на вірусний титр.
Аналіз електронної мікроскопії
Проби негативного контролю, які спостерігаються під електронним мікроскопом, містили інтактні частки вірусу без видимих морфологічних змін або ушкоджень; були чітко виражені пепломери білка S (корона), відзначалася інтактна вірусна оболонка (рис. 2А, В). З іншого боку, у зразках під впливом високої концентрації випробуваного препарату – ЦПХ у вигляді вільної активної речовини (рис. 2С, D) або льодяників БГ/ЦПХ (рис. 2Е, F) – відзначається руйнування вірусної оболонки з нечітким утворенням пепломерів або навіть без пепломерів та оболонки. Вплив випробуваних препаратів на вірус серйозно пошкодив зовнішній шар вірусної оболонки, що є найімовірнішою причиною втрати інфікувальної здатності вірусу. При деяких пошкоджених вірусах видно внутрішній нуклеокапсид. Також відзначається руйнування оболонки вірусу з накопиченням контрастного засобу у внутрішній частині вірусу (чорний центр вірусу).
Рис. 2. Електронні мікрознімки вірусних часток після ультрацентрифугування та негативного контрастування
А, В – вірусні частки в підтримувальному середовищі, які не піддавалися впливу випробуваного препарату; збільшення в 50 000 разів (A) та 80 000 разів (B); інтактні частки SARS-CoV-2 із пепломерами (корона). C, D – 15-хвилинна дія високої концентрації ЦПХ (0,25 мг/мл); збільшення у 80 000 разів (C) та 100 000 разів (D); пошкоджені вірусні частки, рідко видні пепломери, пошкоджена вірусна оболонка та незахищений внутрішній нуклеокапсид. E, F – 15-хвилинна дія високої концентрації БГ/ЦПХ льодяника (1 льодяник у 4 мл); збільшення в 60 000 разів (E) та 100 000 разів (F); пошкодження зовнішнього шару та накопичення негативного контрастного засобу всередині нуклеокапсиду (чорний центр вірусу), рідкісні пепломери, пошкодження зовнішнього шару та нуклеокапсиду (F).
Обговорення
Віруліцидна активність ЦПХ щодо деяких вірусів, які мають оболонку, досліджена та підтверджена [12]. Це дослідження in vitro продемонструвало віруліцидну дію ЦПХ та комбінації БГ і ЦПХ у вигляді вільної активної речовини й у формі льодяників на вірус SARS-CoV‑2.
Віруліцидний тест, проведений у контрольованих лабораторних умовах на суспензії випробовуваних препаратів у високій концентрації, продемонстрував зниження концентрації інфекційного вірусу в 10 000 разів (99,99%), тобто 4-log зниження, що є стандартом щодо віруліцидної активності.
Швидкість зниження інфекційних вірусів знижується одночасно зі зниженням концентрації випробуваного препарату. Було продемонстровано значну різницю між віруліцидною активністю льодяника БГ/ЦПХ та льодяника плацебо, особливо у високій і середній концентраціях суспензії випробуваного препарату.
Комбінація БГ та ЦПХ у вигляді льодяника показала швидший віруліцидний ефект порівняно з ЦПХ у вигляді вільної активної речовини, оскільки достатнє 4-log зниження вірусної концентрації відзначалося після 1 хв впливу високої концентрації. Подібне зниження відзначалося тільки після 15 хв впливу ЦПХ у вигляді вільної активної речовини й між 5 та 15 хв впливу льодяника БГ/ЦПХ середньої концентрації (розчиняли у 20 мл), що є концентрацією, котра теоретично досягається при реальному використанні льодяника для лікування горла.
Якщо взяти до уваги швидкість слиновиділення – 4,0-5,0 мл/хв – під час їди, жування й інших стимулювальних дій (наприклад, застосування льодяника) [15] та час, потрібний для розчинення льодяника (в середньому 5 хв), постійне вивільнення активних речовин із льодяника, то середня концентрація випробуваних препаратів (суспендовані у 20 мл) гіпотетично може бути досягнута при фактичному застосуванні льодяника в роті.
Льодяник, суспендований у 30 мл (низька концентрація) не досягав 4-log зниження протягом 15 хв. ЦПХ у вигляді вільної активної речовини також не продемонстрував 4-log зниження протягом 15 хв впливу в суспензії середньої та низької концентрації. Проте відзначалася чітка тенденція до зниження вірусу в усіх концентраціях випробуваного препарату протягом 15 хв дії (за винятком льодяника плацебо).
Важливим є також додатковий висновок дослідження – це високоефективна віруліцидна активність комбінації БГ/ЦПХ у вигляді як льодяника, так і вільної активної речовини, яка має швидший ефект порівняно з тільки ЦПХ. Було встановлено, що БГ як додатковий компонент впливає на дестабілізацію та втрату інфікувальної здатності вірусних часток. Додатковим параметром суспензії льодяника, що впливає на динаміку віруліцидності, може бути екстремальне кислотне середовище. У суспензіях вільної активної речовини ЦПХ і БГ/ЦПХ значення рН у всіх випробуваних концентраціях у середньому становило 7,65 та 7,78, що близько до нейтрального. Проте в льодянику БГ/ЦПХ значення рН у середньому становило 3,90. Очевидно, що низьке значення рН суспензії льодяника комбінації БГ/ЦПХ у нашому дослідженні може бути додатковим чинником, який має синергетичну дію, що впливає на дуже швидку втрату інфікувальної здатності вірусу. Дослідження також підтвердило, що значення рН дуже впливає на стабільність та інфікувальну здатність вірусу в навколишньому середовищі [16]. Як в екстремальному кислотному середовищі, так і в екстремальному лужному середовищі вірусні білки на поверхні незворотно денатурували, що призвело до зниження інфікувальної здатності вірусу.
Віруліцидний ефект ЦПХ та льодяників у комбінації БГ/ЦПХ додатково відзначався при морфологічному аналізі вірусних часток. Після інкубації вірусу в суспензії ЦПХ у вигляді вільної активної речовини та комбінації БГ/ЦПХ у формі льодяника було відзначено подібний ефект, тобто порушення вірусної оболонки. На тлі льодяника БГ/ЦПХ спостерігали дестабілізацію нуклеокапсиду, що може бути пов’язана з низьким рН навколишнього середовища, якому піддавався вірус [17].
Слід підкреслити, що місцем дії льодяників є слизова оболонка ротової порожнини та глотки, що тяжко змоделювати в лабораторних умовах in vitro. Додатковий момент, який варто враховувати, полягає в тому, що потенційною активністю in vivo льодяника є лише його вплив на віруси, що виділяються інфікованими клітинами, та віруси в слині. Результати попередніх досліджень показали, що концентрація вірусів у слині перебуває в діапазоні 4-6 log10 копій генома на мл [18-20], при цьому найвища концентрація спостерігається через 5-6 днів після появи симптомів. У цій процедурі дослідження концентрація вірусу була набагато більшою – між 8,00 та 10,00 log10 TCID50/мл.
Вірус SARS-CoV‑2 переважно передається через респіраторні краплі, а вірусна частка залишається життєздатною в аерозолях протягом 3 год [21, 22]. Профілактичні заходи, як-от гігієна рук, маски для обличчя та соціальне дистанціювання, є основними засобами боротьби з інфекцією. Досі взаємозв’язок між вірусним навантаженням у легенях і горлі з точки зору тяжкості захворювання незрозумілий, а також невідомо, як зниження вірусного навантаження в горлі може вплинути на захворювання легень або передачу вірусу. Якщо очікується, що вища концентрація вірусу в горлі може збільшити можливість зараження інших, тоді стратегія зниження кількості інфекційних вірусних часток слизової оболонки може сприяти зниженню ризику передачі інфекції. Тож, якщо припускаємо, що горло є основним місцем реплікації на ранніх стадіях, застосування місцевих засобів, які можуть пошкодити або зруйнувати ліпідну оболонку вірусу, може потенційно знизити вірусне навантаження в ротоглотці.
Декілька звітів про клінічні випадки також підтвердили ефективність полоскання порожнини рота в зниженні навантаження вірусу SARS-CoV‑2 у слині [23-25].
Потрібно провести подальше розслідування механізму віруліцидної активності та клінічних ефектів льодяників із комбінацією БГ/ЦПХ для контролю інфекцій респіраторного тракту.
Висновки
Результати, представлені в цьому дослідженні, ґрунтуються на контрольованих і певних лабораторних умовах, що імітують фізіологічні умови ротової порожнини. Усі активні випробувані препарати, тобто ЦПХ, БГ/ЦПХ у вигляді вільної активної речовини та БГ/ЦПХ у формі льодяника, продемонстрували важливу віруліцидну активність в умовах in vitro.
Дослідження додатково підтвердило значну різницю між льодяниками в комбінації БГ/ЦПХ і льодяниками плацебо, а також сильніший ефект комбінації БГ/ЦПХ або у формі льодяників, або у вигляді вільної активної речовини порівняно з тільки ЦПХ.
Список літератури знаходиться в редакції.
Steyer A., Marušić M., Kolenc M., Triglav T. A throat lozenge with fixed combination of cetylpyridinium chloride and benzydamine hydrochloride has direct virucidal effect on SARS-CoV‑2. COVID. 2021; 1 (2): 435-446.
