8 квітня, 2025

Отилонію бромід підсилює антимікробну активність колістину проти грамнегативних патогенів та їхніх персистерів

Колістин залишається антибіотиком останньої лінії проти грамнегативних патогенів, однак його клінічне застосування обмежене через токсичність та зростаючу резистентність бактерій. У цьому дослідженні ідентифіковано схвалений Управлінням з контролю за харчовими продуктами та лікарськими засобами США (FDA) препарат отилонію бромід (Ob), який здатний відновлювати активність колістину проти колістинрезистентних грамнегативних бактерій як in vitro, так і на моделі інфекції у мишей. Завдяки використанню комплексного підходу і включенню мікробіологічних, біохімічних та мікроскопічних методів продемонстровано, що Ob не лише відновлює чутливість резистентних штамів до колістину, але й знижує його необхідну терапевтичну дозу для чутливих штамів, у такий спосіб зменшуючи його токсичність. До того ж комбінація Ob із колістином виявилася ефективною у знищенні мультирезистентних персистерів грамнегативних бактерій in vitro.

Інфекційні захворювання, спричинені мультирезистентними (МР) патогенами, стали серйозною та стрімко прогресуючою проблемою охорони здоров’я в усьому світі [1]. Згідно з попереднім оглядом щодо антимікробної резистентності, інфекції, спричинені МР-штамами, можуть призвести до понад 10 мільйонів смертей на рік до 2050 р., якщо не будуть вжиті проактивні заходи для уповільнення тенденції резистентності до ліків, що швидко зростає [2]. Поява детермінант резистентності blaNDM‑1 і blaKPC‑2, які є високо трансмісивними серед штамів різних видів і відомі тим, що кодують резистентність до карбапенемів, призводить до подальшого зменшення кількості терапевтичних опцій, що залишаються [3-5].

Колістин, або поліміксин E, є полікатіонним антимікробним пептидом, що вважається одним з антибіотиків останньої лінії, які можна використовувати для лікування інфекцій, спричинених МР грамнегативними штамами, особливо карбапенемрезистентними Enterobacteriaceae (CRE), завдяки його високій ефективності та низькому рівню резистентності [6]. Колістин проявляє електростатичну зв’язувальну спорідненість до негативно зарядженого ліпіду А в молекулах ліпополісахариду (ЛПС), розташованих на поверхні грамнегативних бактерій, що призводить до пошкодження мембрани та витоку клітинного вмісту і, отже, загибелі бактеріальних клітин [7]. Однак клінічна цінність колістину обмежена його нефро- та нейротоксичністю [8].

Крім того, все частіше інформують про резистентність до колістину. Мутації в генах phoPQ та pmrAB, які кодують дві різні компонентні системи, а також мутації гену mgrB, як повідомлялося, пов’язані з надекспресією ферментів модифікації ліпіду А, таких як EptA, а також зі зниженою спорідненістю ліпіду А до поліміксинів [9, 10]. Останнім часом в усьому світі інформують про новий механізм резистентності до колістину, опосередкований кодованим плазмідою ферментом MCR‑1, який каталізує модифікацію ліпіду А [11-16]. Найгірше те, що мобільний ген резистентності до колістину mcr‑1 все частіше набувається штамами CRE, що несуть гени blaKPC [17], blaNDM [18] і blaVIM [19], через що ці штами здатні еволюціонувати в справжні «супербактерії», які є резистентними практично до всіх відомих антимікробних засобів.

Тому терміново потрібні нові стратегії, які здатні подолати резистентність до колістину у грамнегативних патогенів, особливо CRE. Порівняно з тривалим і дорогим процесом розроблення нових антибіотиків, виявлення ад’ювантів колістину, які можуть відновити активність колістину та зменшити дозу лікування, є більш ефективною і екологічною стратегією для відновлення або навіть підвищення клінічної цінності колістину як антибіотика останньої лінії [20, 21].

Ob, схвалений FDA спазмолітичний препарат, широко застосовується для лікування пацієнтів, які страждають на синдром подразненого кишечника (СПК) [22]. Підтверджено, що Ob може блокувати кальцієві канали L- і T-типу та мускаринові і тахікінінові рецептори в гладких м’язах [23]. Ob погано всмоктується людськими клітинами, тому не повідомлялося про значні побічні ефекти під час його клінічного застосування [24]. Хоча про антимікробні ефекти Ob на Clostridioides difficile [25] та Staphylococcus aureus [26] сповіщалося в попередніх дослідженнях, потенціал використання Ob для лікування інфекцій, спричинених грамнегативними патогенами, не досліджувався.

У цьому дослідженні спостерігався сильний синергічний антимікробний ефект при спільному використанні Ob і колістину для пригнічення росту і колістинрезистентних, і чутливих грамнегативних штамів in vitro. Комбінація препаратів виявилася особливо ефективною під час лікування інфекцій, спричинених колістинрезистентними CRE в експериментах in vivo. У цій роботі досліджувалися механізми, що лежать в основі цього синергічного антимікробного ефекту. Відкриття Ob як нового і безпечного ад’юванта колістину надає новий варіант для боротьби з інфекціями, спричиненими МР грамнегативними патогенами.

Результати та обговорення

Для ідентифікації потенційних ад’ювантів колістину використовували штам E. coli J53 з природною mcr‑1-несучою плазмідою IncI2 (33 kb, KX711706.1) [27]. Завдяки методу шахової дошки виявлено синергічну дію Ob з колістином (FICI = 0,25), що забезпечило значне, 32-кратне зниження мінімальної інгібуючої концентрації (МІК) колістину (з 8 мкг/мл до 0,28 мкг/мл) при додаванні 20 мкг/мл Ob. Важливо зазначити, що таке зниження МІК достатнє для досягнення рівня нижчого за клінічну точку відсічення (2 мкг/мл, згідно із CLSI 2020). Для колістинчутливого штаму E. coli J53 спостерігався ще сильніший синергізм (FICI ≤0,141), де МІК знижувалась з 1 мкг/мл до ≤0,016 мкг/мл при використанні лише 10 мкг/мл Ob (рис. 1).

Подальші дослідження продемонстрували, що цей синергічний антимікробний ефект поширюється на широкий спектр грамнегативних патогенів включно з Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii та Salmonella spp. У присутності 20 мкг/мл Ob ефективна бактерицидна концентрація колістину значно знижувалась: для резистентних штамів – із 32 мкг/мл до 8 мкг/мл, для чутливих штамів – з 8 мкг/мл до 1 мкг/мл.

Аналіз життєздатності клітин методом LIVE/DEAD підтвердив високу ефективність комбінації: при використанні 20 мкг/мл Ob із 4 мкг/мл колістину спостерігалась загибель >97% бактеріальних клітин. Особливо важливими виявились результати in vivo на моделі сепсису у мишей, де комбінована терапія забезпечила 80% виживаності протягом 48 годин, тоді як монотерапія колістином або Ob окремо була неефективною і всі тварини гинули протягом 36 годин після інфікування.

Механістичні дослідження показали, що синергічний ефект реалізується через комплексний вплив на бактеріальну клітину: підвищення проникності мембрани, порушення протонрушійної сили (Proton motive force – PMF) та пригнічення ефлюксних насосів, що сукупно призводить до незворотного пошкодження клітин та їхньої загибелі.

Для елімінації толерантних субпопуляцій характерна висока ефективність проти стійких до антибіотиків субпопуляцій, що спричиняють хронічні та рецидивуючі інфекції, особливо в імунокомпрометованих пацієнтів [28, 29]. При використанні 20 мкг/мл Ob з 2 мкг/мл колістину досягалась повна елімінація толерантної популяції протягом 24 годин, тоді як монотерапія колістином (32 мкг/мл) залишала життєздатними 5×10⁵ КУО/мл з початкової популяції 10⁸ КУО/мл.

Механізми порушення цілісності мембрани включають витіснення двовалентних іонів (Ca²⁺ і Mg²⁺) із фосфоліпідів [33, 34] та порушення стабільності мембранної структури через втрату кросс-лінкерів [35]. Амфіпатична природа Ob, що містить гідрофільний четвертинний амін та гідрофобний вуглецевий ланцюг, сприяє його проникненню в мембрану [47, 48]. Ці ефекти підтверджено методом SYTOX Green та електронною мікроскопією.

Вплив на енергетичний метаболізм проявляється через потужну дисипацію PMF, швидкість якої перевищує дію валіноміцину. Це призводить до порушення синтезу АТФ та транспорту розчинених речовин [36], викликаючи деполяризацію мембрани з подальшою клітинною дисфункцією.

Пригнічення систем резистентності характеризується сильним інгібуванням ефлюксних насосів, що перевершує ефективність карбоніл ціанід м-хлорфеніл гідразон [37-39]. Інгібуючий ефект зберігається навіть при додаванні глюкози та не залежить від наявності гену mcr‑1, що призводить до накопичення антибіотиків всередині клітини.

Порушення рухливості включає пригнічення формування та функціонування джгутиків [40-42], зменшення здатності до роїння у P. aeruginosa та підвищення експозиції бактерій до антибіотиків.

Комбінований ефект цих механізмів (рис. 2) призводить до незворотного пошкодження бактеріальних клітин та їхньої загибелі [50]. Особливо важливо, що Ob схвалений FDA як препарат без серйозних побічних ефектів [24], що робить його перспективним ад’ювантом для зниження терапевтичних доз колістину та подолання проблеми антибіотикорезистентності.

Отже, Ob, схвалений FDA препарат для лікування СПК, може виступати потужним ад’ювантом колістину. При комбінованому застосуванні з Ob ефективність колістину значно зростає: МІК колістину знижується в 32 рази для резистентних штамів, терапевтична доза може бути суттєво зменшена, а комбінація забезпечує 80% виживаності на моделі сепсису в мишей. Механізм дії базується на комплексному впливі через порушення цілісності бактеріальної мембрани, дисипацію протонрушійної сили, пригнічення ефлюксних систем та зниження бактеріальної рухливості.

За матеріалами Xu C., Liu C., Chen K. et al. (2022) Otilonium bromide boosts antimicrobial activities of colistin against Gram-negative pathogens and their persisters. Commun Biol 5, 613. https://doi.org/10.1038/s42003-022-03561-z

Підготувала Анна Сочнєва

Тематичний номер «Гастроентерологія. Гепатологія. Колопроктологія» № 1 (75) 2025 р.