25 листопада, 2022
Характеристика лабораторних методів діагностики вовчакового антикоагулянту
Останнім часом широкого поширення набувають дослідження та діагностика тромбофілій. До найзначущіших набутих тромбофілій належить антифосфоліпідний синдром (АФС), який являє собою гетерогенне автоімунне захворювання, що характеризується артеріальними й венозними тромбоемболічними ускладненнями з наявністю антифосфоліпідних антитіл (АФЛ) [1-3]. Оскільки клінічні прояви АФС не мають специфічності, діагноз істотно залежить від виявлення циркулювальних АФЛ. Ці АФЛ є автоантитілами, спрямованими проти комплексу фосфоліпідів і фосфоліпідозв’язувальних білків [1-4].
Розгляд хронології досягнень у галузі медичних знань може надати корисну інформацію про патогенез, діагностику та лікування захворювань. Історія вивчення АФЛ бере свій початок на зорі XX століття з розробки діагностичних тестів на сифиліс (Treponema pallidum) – дуже поширеного на той час інфекційного захворювання. Стислу історію АФС представлено в таблиці 1.
На сьогодні досягнуто значних успіхів у розумінні патогенезу та клінічних проявів АФС із використанням доказової бази для застосування оптимальної терапії.
Лабораторна діагностика АФС полягає у виявленні АФЛ. Достатнім лабораторним критерієм може бути будь-який із трьох компонентів, що визначається протягом не менш як 12 тиж після клінічних проявів:
1) ВА в плазмі у ≥2 випадках з інтервалом не менш як 12 тиж;
2) антикардіоліпінові антитіла (АКЛ) класу IgG та/або IgM у сироватці чи плазмі в середньому чи високому титрі (>40 GPL або MPL, >99 процентилю) з інтервалом не менш як 12 тиж;
3) анти-β2-глікопротеїн I (анти-β2-ГП I) класу IgG та/або IgM у сироватці чи плазмі в середньому чи високому титрі (>40 GPL або MPL, >99 процентилю) з інтервалом не менш як 12 тиж.
Із цих лабораторних критеріїв на особливу увагу заслуговує важливість визначення ВА, що зумовлено таким:
- саме наявність ВА асоціюється з розвитком тромбозів;
- результати виявлення ВА й АКЛ не завжди збігаються. За деякими даними, ВА виявляється частіше, ніж АКЛ.
Спектр клінічних дисциплін, за яких виникає необхідність досліджувати ВА у зв’язку з підозрою на АФС, дуже широкий і містить ревматологію, кардіологію, акушерство, неврологію, хірургію, гематологію, нефрологію й інші медичні дисципліни. Ці чинники свідчать про необхідність ширшого впровадження в клініку методів визначення АФЛ, зокрема й ВА. Діагностика ВА є, з одного боку, вкрай важливою в різних галузях медицини, а з другого – це дуже складне методичне завдання.
Патофізіологія ВА
ВА являє собою групу гетерогенних автоантитіл (IgG та/або IgM), задіяних у кровообігу, здатних зв’язуватися з негативно зарядженими фосфоліпідозв’язувальними білками, як-от β2-глікопротеїн I і протромбін [12] (рис. 1).
Рис. 1. β2-глікопротеїн I складається з п’яти гомологічних доменів (домен V зв’язується з аніонною фосфоліпідною поверхнею, тоді як антитіла до β2-глікопротеїну I – з доменом I)
ВА вперше був описаний у 1952 р. C. L. Conley та R.C. Harman у 2 пацієнтів із СЧВ, які мали геморагічний діатез; вони назвали його вовчаком, оскільки він був описаний в обох пацієнтів із СЧВ, а антикоагулянт має таку назву через те, що в цих хворих спостерігалася кровотеча. Термін ВА є своєрідним парадоксом, адже більшість пацієнтів із ВА мають тромбоз, а не кровотечу. Незважаючи на те що in vivo ВА індукував тромбози, in vitro він спричиняв подовження активованого часткового тромбопластинового часу (АЧТЧ). Пацієнти зі збільшеним АЧТЧ (за інших нормальних показників коагулограми) не мали проявів кровотечі та водночас у них могли розвиватися тромбози, тобто з’явилася парадоксальна реакція – подовження АЧТЧ і розвиток тромбозу. Не в усіх пацієнтів із СЧВ є ВА; і, хоча ВА збільшує час зсідання, він не спричиняє кровотечі in vivo. Отже, термін ВА є подвійним неправильним позначенням. Механізм виникнення тромбозу у хворих із ВА точно не встановлено. Існує низка механізмів, які були запропоновані для пояснення того, як ВА зумовлюють тромбоз in vivo. Деякі з них полягають в інгібуванні активованого протеїну C, порушенні регуляції тромбіну, зміні фібринолізу й активації ендотеліальних клітин.
Лабораторні тести для визначення ВА
Для виникнення коагуляції потрібні фосфоліпідні поверхні, на яких утворюються коагуляційні комплекси (зовнішній, внутрішній теназний, протромбіназний) із формуванням тромбіну та кінцевого продукту фібрину. За наявності ВА в плазмі з’являється перешкода для прикріплення цих коагуляційних комплексів до поверхні фосфоліпідів в аналізах коагуляції in vitro, якщо в реагенті є обмежена кількість фосфоліпідів. У результаті обмеженої концентрації фосфоліпідів у реагенті фосфоліпідозалежні аналізи на основі згустка, як-от АЧТЧ, подовжуються. Реагенти AЧТЧ відрізняються концентрацією фосфоліпідів, що сприяє чутливості реагенту до ВА. Отже, залежно від концентрації фосфоліпідів деякі реагенти AЧТЧ виявлятимуться чутливішими до ВА, що зумовлює подовження AЧТЧ (низька концентрація фосфоліпідів), тоді як інші можуть бути не такими чутливими та демонструвати нормальні результати AЧТЧ (підвищена концентрація фосфоліпіду). Це пролонгування не відбувається in vivo, оскільки існує необмежене джерело фосфоліпідів на тромбоцитах та еритроцитах у кровотоку, а також на ендотелії [13].
Клінічна лабораторія відіграє важливу роль у діагностиці ВА. Існує низка відмінностей у лабораторних методах щодо обрання тестів, процесу тестування й інтерпретації стосовно ВА [14]. Для підвищення діагностичної точності тестування ВА експертні комісії запропонували настанови для лабораторій, які містять преаналітичний, аналітичний і постаналітичний етапи (табл. 2).
У 2009 р. опубліковано оновлену настанову Міжнародного товариства з тромбозу та гемостазу (ISTH) [15] щодо виявлення ВА, після чого у 2012 р. було видано оновлену настанову Британського комітету зі стандартизації в гематології (BCSH) [16]. У 2014 р. Інститут клінічних і лабораторних стандартів (CLSI) також опублікував настанову з виявлення ВА [17] (табл. 3).
Для ідентифікації ВА існує декілька різних методик, що застосовуються в клінічних лабораторіях. До них належать тест із розведенням отрути гадюки Рассела (dRVVT), час зсідання з діоксидом кремнію (SCT), гексагональна фаза нейтралізації фосфоліпідів (STACLOT-LA), каоліновий час зсідання (KCT), розведення протромбінового часу (dPT), процедура інгібування тканинного тромбопластину та два не так часто використовувані тести – час отрути тайпану та коефіцієнт текстарин/екарин [18] (рис. 2).
Рис. 2. Деякі з найчастіше виконуваних тестів для визначення ВА та їхня взаємодія в каскаді когуляції
Оскільки через гетерогенність антитіл до ВА проведення лише одиничного тесту не дає змоги виявити ВА, всі три експертні групи рекомендують лабораторіям виконувати щонайменше два різні аналізи, засновані на відмінних принципах тестування. До таких аналізів належать тест dRVVT, SCT і STACLOT-LA.
Тест dRVVT
Тест dRVVT визнається всіма трьома групами експертів як один із початкових аналізів, які мають бути здійснені під час скринінгу ВА. Низка дослідників довела, що dRVVT чутливий до β2GPI-залежних антитіл і дуже корелює з тромбозом. Цей аналіз заснований на активації фактора X (FX), отриманого з отрути гадюки Рассела (Daboia russelii). За наявності FVa, FXa, фосфоліпідів, іонів кальцію протромбін перетворюється на тромбін, який згодом перетворює фібриноген на фібрин (рис. 3).
Рис. 3. Механізм дії розведеної отрути гадюки Рассела на коагуляційний каскад (фермент, наявний в отруті гадюки Рассела, перетворює FX на FXa)
Набір dRVVT складається з двох компонентів; перший – реагент, який містить низьку кількість фосфоліпідів, що робить його дуже чутливим до ВА. Коли до реагенту для скринінгу додають плазму пацієнта, що містить ВА, час зсідання збільшується, оскільки антитіла, наявні в плазмі, впливають на здатність протромбіназного комплексу зв’язуватися з поверхнею фосфоліпіду. Другим компонентом є підтверджувальний реагент, який містить підвищену кількість фосфоліпіду. Додаткові фосфоліпіди нейтралізують антитіла, забезпечуючи збільшену площу поверхні зв’язування комплексу протромбінази, що спричиняє скорочення часу зсідання порівняно зі скринінговим аналізом (рис. 4).
Рис. 4. Тест dRVVT (А – скринінговий, Б – підтверджувальний)
Інтегрованим аналізом вважається одночасне використання скринінгового та підтверджувального тестів [19]. У декількох дослідженнях продемонстровано, що тест dRVVT є специфічним для виявлення ВА в пацієнтів із високим ризиком розвитку тромбозу та чутливішим порівняно з KCT [20, 21]. Проте dRVVT може надавати хибнопозитивні результати в пацієнтів, які отримують АВK. Існують дані, що антитіла до дефіциту FV заважають проведенню аналізу [22]. Лабораторіям рекомендується здійснювати розрахунок співвідношення скринінгу dRVVT (результат скринінгу dRVVT пацієнта / середнє значення скринінгу dRVVT нормальної плазми та підтвердження dRVVT, тобто співвідношення хворого dRVVT підтвердження / середнє значення підтвердження dRVVT нормальної плазми) з подальшим розрахунком інтегрованого результату.
SCT
Набір SCT (компанія WERFEN, м. Барселона, Іспанія) є ще однією інтегрованою тестовою системою, що складається з двох компонентів, аналогічних dRVVT. Суспензія колоїдного діоксиду кремнію використовується в реагенті для активації FXII внутрішнім шляхом (рис. 5).
Рис. 5. Аналіз часу зсідання з діоксидом кремнію (SCT). Мікронізований діоксид кремнію використовується для активації внутрішнього шляху. Антитіла ВА (червоного кольору) перешкоджають зв’язуванню внутрішніх комплексів тенази та протромбінази на поверхні тромбоцитів
Плазма пацієнта, призначена для дослідження на ВА, додається до реагенту, що містить низьку концентрацію фосфоліпіду. Така концентрація підвищує чутливість реагенту за наявності ВА, що зумовлює збільшення часу зсідання. У підтверджувальному тесті плазму пацієнта додають до другого реагенту, що містить підвищену кількість фосфоліпіду. Додатковий фосфоліпід нейтралізує антитіла шляхом збільшення площі поверхні для внутрішніх комплексів тенази та протромбінази, що скорочує час зсідання. У деяких дослідженнях було показано, що цей аналіз є найчутливішим аналізом виявлення ВА в пацієнтів, які відповідають клінічним критеріям АФС. Цей тест може бути нечутливим до АВК, а специфічні антитіла FVIII здатні заважати інтерпретації результатів. Рекомендується, щоб лабораторії розраховували співвідношення SCT (результат скринінгу пацієнта / середнє значення нормальної плазми скринінгу), а також співвідношення підтверджувального тесту SCT (результат підтвердження пацієнтом / середнє значення підтвердження нормальної плазми) та представляли інтегрований результат як нормалізоване співвідношення (скринінг/підтвердження). Співвідношення >1,16 свідчить про наявність ВА [23].
Медична газета «Здоров’я України 21 сторіччя» № 12 (529), 2022 р.
