24 травня, 2025
Lactobacillus sakei Pro-Bio65 знижує експресію TNF-α та стимулює антиоксидантну ферментативну активність у клітинах кон’юнктиви людини
Поверхня ока постійно зазнає впливу зовнішнього середовища, отже, й різних видів мікроорганізмів. Хоча дослідження мікробіому ока тільки розпочалися, методи секвенування генів 16S рибосомної РНК показали наявність резидентної мікробіоти на поверхні ока (Ozkan J., Willcox M.D., 2019). Вона, як і мікробіота в кишечнику, роті чи на шкірі, є важливою для здоров’я очей. Кількісні зміни мікробіоти під впливом навколишнього середовища, факторів господаря, антибіотиків і захворювань можуть впливати на метаболізм, проліферацію та виживаність епітеліальних клітин слизової оболонки. Отже, вони можуть бути кофактором у патогенезі поширених очних захворювань (Lu L.J. et al., 2016; Baim A.D. et al., 2019).
Цілком обґрунтовано припустити, що пробіотики чи парапробіотики здатні позитивно регулювати функцію очного епітеліального бар’єра. Вони можуть бути перспективними засобами для запобігання очним захворюванням і покращення функцій та здоров’я очей шляхом зменшення прозапальних цитокінів, відновлення окисно-відновного статусу й пригнічення надмірного росту патогенних бактерій (Vitetta L. et al., 2018; Zhang C.X. et al., 2019). З огляду на ризики бактеріальної транслокації та інфекції при застосуванні пробіотиків цінною альтернативою є використання парапробіотиків – нежиттєздатних бактеріальних клітин, або бактеріальних компонентів. Наприклад, було показано, що лізат бактерій Lactobacillus sakei proBio‑65 (L.SK) та його біоактивна сполука SEL001 чинять протизапальну дію при атопії та псоріазі (Kim H. et al., 2015; Rather I.A. et al., 2020). Також повідомлялося про антиоксидантні властивості екзополісахариду, отриманого із L.SK (Bajpai V.K. et al., 2016).
Нещодавно Роберто Іоріо та співавт. із відділу біотехнологічних і прикладних клінічних наук Університету Л’Аквіли (Італія) досліджували гіпотезу про те, що лізат бактерій L.SK у формі офтальмологічного 4% розчину може стимулювати фізіологічну генерацію активних форм кисню (ROS) і впливати на ферментативні й неферментативні механізми антиоксидантного захисту кон’юнктивального епітелію людини. Експеримент проводили на культурі епітеліальних клітин людини (HCE), яку після культивації за стандартних умов зволоженої атмосфери при температурі 37 °C та 5% CO2 піддавали впливу розчину L.SK різної тривалості. Методами імуноферментного аналізу, потокової цитометрії та флуоресцентної мікроскопії досліджували життєздатність клітин, зміни маркерів окисного стресу, запалення та антиоксидантного захисту. Нижче наведені основні результати експерименту.
L.SK не впливає на проліферацію та життєздатність клітин HCE
Клітини HCE зазнавали впливу L.SK протягом 24 і 48 год, після чого ріст та життєздатність клітин оцінювали за допомогою тестів із трипановим синім і метилтіазол-тетразолієм (MTT). Під час порівняння груп, які отримували вплив, із контрольними групами не виявлено суттєвих відмінностей. Отже, було встановлено, що обробка L.SK не спричиняє змін у проліферації та життєздатності клітин кон’юнктивального епітелію людини.
L.SK індукує помірне підвищення рівнів внутрішньоклітинних активних форм кисню
Клітини HCE інкубували в присутності L.SK протягом 30 хв і 2 год, а потім аналізували на флуоресценцію в присутності 2,7-дихлорфлуоресцеїну діацетату (DCFH2-DA). L.SK індукував незначне, але статистично значуще збільшення внутрішньоклітинної генерації ROS, яке було помітним уже після 30 хв інкубації (30 хв – на ≈24%; 2 год – на ≈30%).
L.SK зумовлює зниження потенціалу мембран мітохондрій (Δψm) у контексті організації мітохондріальної мережі
Щоб оцінити, чи корелюють індуковані L.SK активні форми кисню з модифікаціями потенціалу мітохондріальної мембрани, функцію мітохондрій вимірювали методом потокової цитометрії після обробки зразків ліпофільним катіонним барвником JC‑1. L.SK знижував Δψm, що супроводжувалося значно нижчою середньою інтенсивністю флуоресценції (на ≈34%) у клітинах, оброблених L.SK упродовж 2 год, порівняно з контрольними групами. Зменшення Δψm свідчить про зміни в динаміці мітохондрій. Проте конфокальний аналіз імунофлуоресцентно мічених мітохондрій з антитілом проти TOMM20 не показав суттєвих відмінностей між контрольною й експериментальною групами, тобто різниці в потенціалі мітохондріальної мембрани, спричинені обробкою L.SK, не відображають змін їхньої морфології та функції.
Обробка L.SK не зумовлює активації шляху NF-κB та спричиняє зниження рівнів експресії TNF-α
З огляду на існування петлі зворотного зв’язку між активними формами кисню і сигнальним шляхом ядерного фактора каппа В (NF-κB), а також можливий зв’язок між мітохондріями та вродженим імунітетом, дослідники відслідкували можливу активацію NF-κB паралельно з дослідженням рівнів цитокінів після інкубації клітин HCE з L.SK. У результаті активність люциферази NF-κB необроблених та оброблених L.SK клітин протягом 2 год інкубації виявилася схожою. При конфокальній мікроскопії контрольних та оброблених (2 год) клітин HCE, забарвлених антитілом проти NF-κB, також не було виявлено факту активації NF-κB. Отже, вестерн-блот-аналіз рівнів експресії про- та протизапальних цитокінів (IL‑1β, IL‑12A, TNF-α, IL‑10) і циклооксигенази-2 (COX2) не показав суттєвих відхилень, за винятком фактора некрозу пухлини-α (TNF-α). Рівні експресії TNF-α через 6 год інкубації зразків із L.SK були значно знижені порівняно з контролем.
Для подальшої характеристики змін окисно-відновного статусу клітин HCE, зумовлених L.SK, були проведені ферментативні та неферментативні аналізи антиоксидантної системи. Загалом позитивний ефект спостерігався вже через 30 хв інкубації та тривав до 2 год. Зокрема, ферментативна активність каталази (CAT), супероксиддисмутази (SOD), глутатіонредуктази (GR) та глутатіонпероксидази (GPx) значно зросла в зразках, що зазнали впливу L.SK протягом 2 год, порівняно з контрольними групами (рис. 1). Активність глутатіонтрансферази (GST) демонструвала таку саму тенденцію, хоча отримані значення були статистично незначущими. Загалом ці результати свідчать про підвищення ефективності ферментативної антиоксидантної системи під впливом L.SK. Окрім значного збільшення окремих специфічних активностей, також спостерігали постійне співвідношення CAT/SOD (контроль=2,657±0,078; L.SK=2,757±0,197), що свідчить про збереження окисно-відновного гомеостазу. Крім того, підвищення співвідношення GPx/SOD (контроль=0,00467±0,0000667; L.SK=0,0332±0,0234), хоча й не є значним, свідчить про вищий потенціал захисту від окисного стресу. Обробка L.SK упродовж 2 год зумовлювала позитивні та значущі зміни у вмісті відновленого глутатіону без зміни рівнів його окисленої форми GSSG. Отже, було зафіксовано позитивний зсув у клітинному окисно-відновному балансі GSH/GSSG, що також підтверджує відсутність стану оксидативного стресу.
Рис. 1. Активація антиоксидантних ферментів SOD, CAT та GR у клітинах НСЕ під дією L.SK
Примітка: * р<0,05.
Практичне значення результатів і подальші перспективи
Окисно-відновні мережі – адаптивна система, що реагує на навколишнє середовище. Не випадково, що активні форми кисню генеруються та динамічно модулюються у відповідь на бактерії. Це дослідження показує, як бактеріальний лізат L.SK підвищує низькі внутрішньоклітинні рівні ROS в епітеліальних клітинах кон’юнктиви людини, не впливаючи на ріст і життєздатність клітин. Надважливим є також те, що не відбулося жодних змін у рівнях окисленої форми глутатіону GSSG та явищах перекисного окислення ліпідів. Індукція ROS під впливом L.SK відбувалася паралельно зі значним зниженням потенціалу мембран мітохондрій без впливу на їхню морфологію та функції. Крім того, L.SK знижує вироблення TNF-α та не стимулює експресії прозапальних цитокінів.
Вплив L.SK на епітеліальні клітини кон’юнктиви значно посилює активність ферментативної антиоксидантної системи. Під час впливу легкого стресу, індукованого L.SK, епітеліальні клітини активують захисну реакцію, збільшуючи антиоксидантну здатність клітин. Ця гіпотеза підтверджується підтримкою та збільшенням індексів CAT/SOD і GPx/SOD. SOD, GPx та CAT є основними антиоксидантними ферментами, безпосередньо задіяними в детоксикації та окисно-відновних реакціях активних форм кисню, підтримуючи гомеостаз, захищаючи клітини кон’юнктиви від цитотоксичності. Відомо, що порушення регуляції цієї системи зумовлює ушкодження мембран перекисним окисленням ліпідів і розвиток захворювань, як-от синдром сухого ока й алергічний кон’юнктивіт (Sakai O. et al., 2015).
Також було виявлено збільшення внутрішньоклітинного вмісту глутатіону та співвідношення GSH/GSSG під впливом L.SK. Глутатіон секретується клітинами кон’юнктиви і є найпоширенішим ендогенним антиоксидантом у слізній плівці. Повідомлялося про участь глутатіону в патогенезі захворювань ока. Зокрема, підвищений оксидативний стрес, перекисне окислення ліпідів і знижений рівень глутатіону пов’язані з кератоконусом (Arnal E. et al., 2011).
З огляду на отримані результати дослідження вважають за доцільне використання парапробіотиків для зміцнення здоров’я очей. Цей напрям профілактики слід ретельно дослідити з огляду на тісний зв’язок між оксидативним стресом і багатьма очними патологіями, включаючи катаракту, кератоконус, ретинопатію, вікові дегенерації, синдром сухого ока. Результати цього дослідження прокладають шлях до вивчення використання L.SK як індуктора ендогенної антиоксидантної системи в профілактиці та лікуванні запальних, вікових і пов’язаних з оксидативним стресом захворювань ока.
Джерело: Iorio R., Petricca S., Luzi C. et al. Lactobacillus sakei pro-Bio65 reduces TNF-α expression and upregulates GSH content and antioxidant enzymatic activities in human conjunctival cells. Transl Vis Sci Technol. 2021; 10 (6): 8.
Реферативний огляд підготував Ігор Петренко
Довідка «ЗУ»
Візалія – це медичний засіб виробництва AB-BIOTICS S.A. (Іспанія), призначений для захисту очної поверхні та стабілізації слізної плівки. Активним компонентом є фосфоліпідна суміш із бактеріального лізату Lactobacillus sakei в концентрації 4%.
Важливо, що наведені дані експериментального дослідження R. Iorio і співавт. підтверджені клінічно. Так, у рандомізованому плацебо-контрольованому дослідженні за участю пацієнтів із хворобю сухого ока (ХСО) лізат L. sakei у формі очних крапель значно зменшував симптоми ХСО і пригнічував запальну відповідь очної поверхні (рис. 2, 3).
Візалія особливо показана при симптомах, зумовлених ушкодженням слізної плівки: почервоніння, подразнення очей зовнішніми факторами чи сухість очей. Очні краплі Візалія завдяки процесу відновлення слізної плівки та підвищеній адгезії позитивних бактерій, природно присутніх на поверхні ока, стабілізують слізну плівку і відновлюють природний захисний бар’єр від дії зовнішніх мікробних агентів, забруднюючих речовин, речовин навколишнього середовища. Візалія також корисна для відновлення нормального функціонального стану слізної плівки, який погіршується під час інфекцій (кон’юнктивіт, блефарит, блефарокон’юнктивіт, ячмінь), офтальмологічних операцій та потребує відновлення. Дозволено використання засобу для дітей будь-якого віку та дорослих. Флакон Візалії оснащений технологічною системою, яка дозволяє зберігати засіб без застосування консервантів. Відсутність консервантів додатково запобігає подразненню очної поверхні.
Рис. 2. Зміни індексу OSDI, проби Ширмера та часу розриву слізної плівки (TBUT) у пацієнтів із хворобою сухого ока до та після 4 тиж застосування L. sakei у формі перорального пробіотика (капсули), офтальмологічного бактеріального лізату (краплі) та плацебо (адаптовано за Heydari et al., 2023)
Рис. 3. Аналіз змін OSDI, проби Ширмера та часу розриву слізної плівки (TBUT) із поправкою на супутні фактори свідчить про чітку ефективність крапель (n=20) проти лікування без крапель (n=20) за всіма 3 клінічними параметрами (всі p<0,001), натомість капсули не мали ані жодного ефекту за самостійного застосування, ані додаткового ефекту в разі застосування в комбінації з краплями (р>0,10) (адаптовано за Heydari et al., 2023)
Медична газета «Здоров’я України 21 сторіччя» № 8 (594), 2025 р
