16 жовтня, 2025
Противірусні ефекти ердостеїну в клітинах, інфікованих респіраторними вірусами
Респіраторні вірусні інфекції залишаються однією з провідних причин захворюваності та смертності в усьому світі, особливо серед дітей, осіб похилого віку, пацієнтів з імунодефіцитом або хронічними захворюваннями. Ці інфекції часто спричиняють загострення хронічного обструктивного захворювання легень (ХОЗЛ) і бронхіальної астми. Найпоширенішими збудниками є риновірус, вірус грипу, респіраторно-синцитіальний вірус (RSV), вірус парагрипу, аденовіруси та коронавіруси, включно із SARS-CoV‑2.
Віруси проникають у клітини епітелію дихальних шляхів за допомогою рецептор-опосередкованого ендоцитозу. Внутрішньоклітинні сенсори розпізнають вірусні компоненти та активують каскад вроджених імунних реакцій, які включають продукування інтерферонів і прозапальних цитокінів. Важливу роль у цьому процесі відіграють інфламасоми – внутрішньоклітинні білкові комплекси, котрі, з одного боку, сприяють активації імунної відповіді, а з іншого – запускають програмовану форму запальної клітинної смерті, відому як піроптоз. У фізіологічних умовах ця реакція допомагає обмежити інфекцію, однак при деяких вірусних захворюваннях (зокрема, при грипі та COVID-19) надмірна або неконтрольована активація інфламасом призводить до надлишкової продукції цитокінів (цитокіновий шторм), ушкодження тканин і тяжкого перебігу захворювання.
Окрему роль у патогенезі вірусних інфекцій відіграє оксидативний стрес. Надлишок активних форм кисню (АФК) ушкоджує клітинні структури, знижує функціональну активність імунних клітин і посилює запалення. При цьому відзначається зниження рівня глутатіону (GSH) – одного з ключових ендогенних антиоксидантів, який регулює окисно-відновний баланс і підтримує імунну відповідь. Дефіцит GSH виявляють у пацієнтів із COVID‑19, грипом, RSV-інфекцією.
Ердостеїн – це тіольний агент із відомою муколітичною дією, який широко застосовується при захворюваннях дихальних шляхів, що супроводжуються підвищеним утворенням в’язкого мокротиння. Водночас ердостеїн демонструє виражені антиоксидантні, протизапальні й антибактеріальні властивості. В організмі він швидко метаболізується до активного метаболіту MET‑1, який забезпечує клінічні ефекти.
Попередні клінічні спостереження показали, що ердостеїн покращує якість життя та зменшує задишку в пацієнтів із COVID‑19. Це спонукало до глибшого дослідження його потенціалу як противірусного та імуномодулювального засобу.
Метою цієї роботи було вивчити вплив ердостеїну та MET‑1 на реплікацію вірусів SARS-CoV‑2, RSV і грипу A (H1N1) у клітинах людини, а також дослідити їхній вплив на вроджену імунну відповідь й оксидативний стрес – ключові механізми в патогенезі вірусних уражень дихальної системи.
Матеріали та методи
У дослідженні використовували культури клітин людського походження: A549-hACE2 (епітелій легень) для моделювання інфекції SARS-CoV‑2 і RSV та Caco‑2 (ентеральний епітелій) для моделювання інфекції вірусом грипу A (H1N1). Клітини інфікували відповідними вірусами, після чого додавали ердостеїн або його активний метаболіт MET‑1 у різних концентраціях.
Для оцінки вірусного навантаження використовували кількісну полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) у реальному часі (для SARS-CoV‑2) і цифрову ПЛР у краплях (ddPCR) для RSV та H1N1. Дослідження впливу на експресію генів імунної відповіді та оксидативного стресу проводили за допомогою ПЛР із кастомними праймерами.
Використовували ердостеїн і МЕТ-1 виробництва Edmond Pharma Srl (Італія). Цитотоксичність оцінювали за допомогою тесту життєздатності клітин. Для порівняння також використовували N-ацетилцистеїн як референсний антиоксидант.
Концентрації ердостеїну, застосовані в експерименті, відповідають дозам, які досягаються в плазмі пацієнтів при рекомендованому клінічному прийомі (300 мг 2 рази на добу).
Статистичну обробку даних проводили з використанням двостороннього t-тесту. Результати подані як середнє ± стандартна похибка середнього; різницю вважали статистично значущою при p<0,05.
Результати
Вплив ердостеїну та MET‑1 на життєздатність клітин
На першому етапі дослідження оцінили, чи не чинять ердостеїн і його активний метаболіт MET‑1 токсичної дії на клітини. За допомогою MTT-тесту було показано, що MET‑1 не знижував життєздатність клітин A549-hACE2 при концентрації 1000 мкг/мл. Лише при максимальній концентрації (2000 мкг/мл) спостерігали зменшення життєздатності приблизно на 35% (рис. 1).
Рис. 1. Вплив ердостеїну і його метаболіту на життєздатність клітин через 72 год після експозиції:
А – вплив MET‑1 у концентрації 1000 і 2000 мкг/мл на життєздатність клітин А549-hACE2;
Б – вплив ердостеїну в концентрації 1000 і 2000 мкг/мл на життєздатність клітин Caco‑2
Аналогічно ердостеїн у концентраціях до 1000 мкг/мл був безпечним для клітин Caco‑2, натомість при застосуванні дози 2000 мкг/мл їхня життєздатність знижувалася на третину. Отже, концентрацію 1000 мкг/мл було обрано для подальших експериментів як нетоксичну та клінічно релевантну.
Противірусна дія ердостеїну та MET‑1 в інфікованих вірусами клітинах
Було досліджено, чи здатні ердостеїн і MET‑1 пригнічувати вірусну реплікацію в умовах клітинної інфекції. Препарати додавали як до зараження (профілактична модель), так і після (терапевтична модель).
Значущого ефекту в режимі доінфекційного введення не спостерігали. Натомість при додаванні після зараження клітин обидва агенти достовірно знижували рівень вірусної РНК у супернатантах (рис. 2). Зокрема:
- у моделі SARS-CoV‑2 (клітини A549-hACE2) MET‑1 у дозі 1000 мкг/мл пригнічував вірусну реплікацію на 91%;
- у моделі RSV – на 94,5%;
- у моделі грипу A (H1N1) ердостеїн у дозі 1000 мкг/мл знижував реплікацію вірусу на 47,5%.
Ці дані свідчать, що ердостеїн і MET‑1 реалізують противірусну дію вже після інфікування клітин, імовірно, впливаючи на внутрішньоклітинні шляхи, пов’язані з імунною відповіддю та оксидативним стресом.
Рис. 2. Противірусні ефекти ердостеїну та його метаболіту: A – клітини A549‑hACE2, інфіковані SARS‑CoV‑2 й оброблені MET‑1; Б – клітини A549‑hACE2, інфіковані RSV та оброблені MET‑1; В – клітини Caco‑2, інфіковані вірусом грипу H1N1 та оброблені ердостеїном
Примітка: N1, N2, NA1 – специфічні ділянки вірусів, які використовують у ПЛР.
Модулювання імунної відповіді та оксидативного стресу під впливом ердостеїну
Для оцінки впливу ердостеїну на ключові механізми імунної відповіді й оксидативного стресу провели транскриптомний аналіз заражених клітин на 72-й годині після інфікування. Найвираженіший ефект виявили при застосуванні концентрації 1000 мкг/мл.
У клітинах, інфікованих SARS-CoV‑2, ердостеїн стимулював експресію генів, пов’язаних із противірусною відповіддю, зокрема інтерферон-індукованих білків (ISG) і компонентів інфламасом. Паралельно спостерігали підвищення активності антиоксидантних систем, включно з генами, які відповідають за метаболізм глутатіону (GPX2, PRDX5, GCLC тощо).
У моделі RSV-інфекції ердостеїн зменшував експресію більшості прозапальних маркерів, натомість підвищував рівень IFITM1 – білка, який обмежує проникнення вірусу в клітину, а також антиоксидантних ферментів CAT і GPX2.
У клітинах Caco‑2, інфікованих H1N1, ердостеїн посилював експресію низки імунних генів (наприклад, IL‑8, CASP8, HLA-A), одночасно підвищуючи рівень антиоксидантних ферментів GPX1, GPX2 та SOD2.
Загалом результати свідчать, що ердостеїн активує механізми противірусного захисту та знижує оксидативне навантаження в інфікованих клітинах. Така дія може бути важливою для обмеження вірусної реплікації та зменшення пошкодження тканин під час інфекції.
Протизапальна дія ердостеїну
Для додаткової оцінки протизапального потенціалу ердостеїну визначили вміст цитокінів у супернатантах клітин A549-hACE2, інфікованих SARS-CoV‑2, через 72 год після зараження. Використовували мультиплексний імуноаналіз із визначенням рівнів 17 про- та протизапальних медіаторів.
Найбільші зміни під впливом ердостеїну зафіксовано щодо інтерлейкіну‑5 (IL‑5), інтерферону-гамма (IFN-γ) та хемокіну MIP‑1β – усі вони демонстрували статистично значущу відповідь на лікування. Рівні IL‑8 і MCP‑1 також змінювалися.
Отримані результати підтверджують, що ердостеїн здатен не лише впливати на вірусну реплікацію, а й м’яко модулювати запальну відповідь на клітинному рівні, що може мати клінічне значення при тяжких респіраторних інфекціях.
Обговорення
У цьому дослідженні in vitro вперше продемонстровано противірусну активність ердостеїну проти SARS-CoV‑2, RSV і вірусу грипу A (H1N1). Хоча механізми цієї дії ще потребують уточнення, отримані результати свідчать, що ердостеїн активує механізми вродженого імунітету, зокрема шляхи інтерферонів І типу та інфламасом, тим самим сприяючи контролю вірусної реплікації. Крім того, ердостеїн впливає на окислювальний стрес, регулюючи експресію генів, залучених до окисно-відновного балансу та глутатіонової системи.
Ердостеїн і його активний метаболіт MET‑1 у концентраціях, які не мали цитотоксичного ефекту на клітини A549-hACE2 або Caco‑2, не виявляли противірусної дії при додаванні до заражених клітин. Натомість введення препаратів після інфікування достовірно знижувало рівень вірусного навантаження. Це вказує на те, що ердостеїн не блокує проникнення вірусу до клітини, а діє внутрішньоклітинно вже після інфекції. Цей висновок узгоджується з даними транскриптомного аналізу: ердостеїн пригнічував внутрішньоклітинну реплікацію вірусів шляхом активації генів вродженого імунітету, зниження експресії прозапальних цитокінів та активації антиоксидантних ферментів.
Вроджений імунітет є першою лінією захисту від вірусних інфекцій. Його компоненти розпізнають патогени та запускають продукування прозапальних цитокінів і хемокінів, що активують адаптивну імунну відповідь. Від якості та інтенсивності вродженої відповіді залежить клінічний перебіг захворювання: надмірна активація може призвести до патологічного системного запалення.
Респіраторні віруси, включно із SARS-CoV‑2, RSV та H1N1, стимулюють продукування інтерферонів, які є ключовими факторами ранньої противірусної відповіді. Інтерферони І та ІІІ типів активуються після розпізнавання вірусних патернів рецепторами вродженого імунітету, як-от Toll-подібні рецептори (TLR), рецептори RIG‑1 та NOD-подібні рецептори. Це запускає сигнальні каскади з активацією інтерферон-регуляторних факторів (IRF) і подальшою експресією ISG, які кодують білки з антивірусною активністю.
У нашому дослідженні ердостеїн підвищував експресію ISG і компонентів інфламасом, зокрема CARD6, CASP1, CASP4, HLA-A, ISG20 і TLR4, і водночас знижував експресію прозапальних цитокінів IL‑6 та IL‑8 в інфікованих SARS-CoV-2 клітинах. Це цілком узгоджується з його противірусною активністю. У клітинах, інфікованих RSV або H1N1, ердостеїн також модулював експресію генів вродженого імунітету.
Раніше продемонстровано, що респіраторні віруси активують різні патерни транскрипційної відповіді в епітеліальних клітинах легень. Наприклад, SARS-CoV‑2 зазвичай асоціюється зі слабкою інтерферон-сигналізацією, але значним індукуванням прозапальних генів. Інші дослідження показали, що клітини A549-hACE2 відповідають на інфекцію RSV високим рівнем експресії генів прозапальних цитокінів і хемокінів. Тож цілком логічно, що ердостеїн пригнічував ці гени в моделі RSV-інфекції. У клітинах Caco‑2, інфікованих H1N1, ердостеїн підвищував експресію окремих ISG і компонентів інфламасом подібно до ефектів у моделі SARS-CoV‑2.
Інфламасоми – це внутрішньоклітинні білкові комплекси, які складаються із сенсорних, адаптерних та ефекторних молекул. Вони активуються у відповідь на вірусну інфекцію та регулюють запальний процес. З одного боку, активація інфламасом сприяє ефективній елімінації вірусу; з іншого – їхня надмірна активність може призводити до гіперзапалення й ушкодження тканин. Деякі віруси здатні пригнічувати інфламасоми, щоб уникнути знищення та забезпечити власну реплікацію всередині клітини.
Найкраще вивченою інфламасомою при респіраторних вірусних інфекціях є комплекс NLRP3 (NOD-подібний рецептор із піриноподібним доменом-3). Його активація супроводжується вивільненням каспази‑1, яка запускає дозрівання прозапальних цитокінів IL‑18 та IL‑1β. Ці медіатори активують макрофаги та Т-клітини, сприяючи вродженій імунній відповіді. Водночас надмірна активація NLRP3 асоціюється з тяжким перебігом COVID‑19 і розвитком цитокінового шторму.
Останні дані свідчать, що глутатіон (GSH) є важливим негативним регулятором активації NLRP3. Екзогенний GSH і його аналоги підвищують внутрішньоклітинний рівень глутатіону, гальмують збирання NLRP3-інфламасомного комплексу та знижують продукування IL‑1β. При респіраторних вірусних інфекціях, зокрема при COVID‑19, рівень GSH зазвичай знижується, і це корелює з тяжкістю захворювання та ризиком летального наслідку. Підвищення внутрішньоклітинного глутатіону може відігравати протекторну роль, обмежуючи гіперактивацію інфламасом.
N-ацетилцистеїн є попередником GSH і може сприяти його відновленню за наявності ферментів синтезу (глутаматцистеїнової лігази та GSH-синтетази). В одному з досліджень in vitro було показано, що попередня інкубація макрофагів і бронхіальних епітеліальних клітин із N-ацетилцистеїном пригнічувала активацію інфламасоми NLRP3, індуковану SARS-CoV‑2.
Респіраторні вірусні інфекції супроводжуються вираженим оксидативним стресом, що проявляється надмірним продукуванням АФК при одночасному виснаженні антиоксидантних резервів, насамперед GSH. Віруси стимулюють експресію ферментів, які генерують АФК, як-от NADPH-оксидаза та ксантиноксидаза. У моделі RSV-інфекції в клітинах A549 підтверджено зростання продуктів перекисного окиснення ліпідів (8-ізопростани, малоновий діальдегід, 4-гідроксиноненаль), зниження співвідношення GSH:GSSG та зменшення експресії антиоксидантних ферментів супероксиддисмутаз SOD1, SOD2 і глутатіон-S-трансферази (GST), при цьому експресія SOD2 залишалася підвищеною.
Вірус-індукований оксидативний стрес активує транскрипційний фактор Nrf2, який підвищує експресію низки генів, котрі беруть участь у біосинтезі GSH та антиоксидантному захисті.
Ердостеїн – тіольна сполука з добре описаними антиоксидантними та протизапальними властивостями. Ми припускаємо, що саме ці властивості можуть забезпечувати захист інфікованих клітин від оксидативного ушкодження. Антиоксидантна дія ердостеїну може бути пов’язана з його здатністю нейтралізувати внутрішньоклітинні АФК і попереджати їхній токсичний ефект, що було підтверджено, зокрема, в моделі оксидативного стресу на клітинах A549-hACE2.
Приймання ердостеїну асоціюється зі зростанням рівня глутатіону в плазмі крові, а також у бронхоальвеолярному лаважі пацієнтів із хронічним бронхітом. Імовірно, ердостеїн може так само підвищувати рівень GSH і в умовах респіраторної вірусної інфекції. Цю гіпотезу підтверджують результати транскриптомного аналізу: в клітинах, інфікованих усіма трьома вірусами, обробка ердостеїном забезпечувала підвищення експресії гена GPX2 – одного з ключових антиоксидантних ферментів. У моделях інфекції SARS-CoV‑2 і RSV також відзначено зростання експресії каталази (CAT), а в клітинах, інфікованих SARS-CoV‑2, – і ферменту PRDX5. Додатково активувалися гени ARTN, GCLC, GUSB та SIRT2, які беруть участь у регуляції окисно-відновного гомеостазу.
Відомо, що респіраторні вірусні або бактеріальні інфекції можуть провокувати загострення ХОЗЛ і бронхіальної астми та погіршувати їхній перебіг. Поглиблене розуміння механізмів таких загострень стимулює пошук засобів із потенціалом превентивного впливу.
У нашій моделі in vitro ердостеїн продемонстрував здатність пригнічувати вірусну реплікацію, модулювати імунну відповідь і підвищувати експресію антиоксидантних генів. Це дозволяє припустити, що препарат може бути корисним для зниження наслідків сезонних вірусних інфекцій. Ба більше, поєднання противірусних, антиоксидантних і протизапальних ефектів ердостеїну може частково пояснювати результати дослідження RESTORE. У цьому багатоцентровому дослідженні додавання ердостеїну (300 мг двічі на добу) до базисної терапії ХОЗЛ протягом 12 міс достовірно знижувало частоту й тривалість загострень у пацієнтів із помірним і тяжким перебігом хвороби та наявністю загострень в анамнезі.
Варто зазначити, що сильною стороною нашого дослідження є оцінка активності ердостеїну щодо кількох важливих для клінічної практики респіраторних вірусів. Час оцінки вірусної реплікації було адаптовано до кінетики кожного збудника (48 год – для SARS-CoV‑2 і H1N1, 72 год – для RSV), а оцінку транскриптомного профілю та цитокінів у супернатантах проводили уніфіковано – на 72-й годині. Відповідно до моделі Sainas і співавт., концентрація ердостеїну 1000 мкг/мл, застосована в досліді, відповідає рівню, який досягається в плазмі при рекомендованій клінічній дозі 300 мг двічі на день.
Висновки
Проведене дослідження продемонструвало, що ердостеїн чинить виражену противірусну дію в умовах in vitro – як у клітинах легень, інфікованих SARS-CoV‑2 і RSV, так і в моделі ентерального епітелію, інфікованого вірусом грипу A (H1N1). Ця дія реалізується вже після проникнення вірусу в клітину, тобто не пов’язана з блокуванням вірусної інвазії, а спрямована на обмеження реплікації вірусу в інфікованих клітинах. Встановлено, що ердостеїн пригнічує вірусну реплікацію шляхом активації противірусних механізмів вродженого імунітету (інтерферони І типу, інфламасоми), а також за рахунок модуляції генів, відповідальних за антиоксидантний захист і синтез глутатіону.
Отримані результати підкреслюють потенціал ердостеїну як багатофункціонального агента в терапії вірус-асоційованих уражень дихальних шляхів. Потрібні подальші дослідження для глибшого розуміння ролі цього препарату в клінічних умовах, зокрема у веденні пацієнтів із вірусними респіраторними інфекціями та загостреннями хронічних легеневих захворювань.
Джерело: Santus P., Strizzi S., Danzo F., Biasin M., Saulle I., Vanetti C., Saad M., Radovanovic D., Trabattoni D. Antiviral Effect of Erdosteine in Cells Infected with Human Respiratory Viruses. Pathogens. 2025 Apr 15; 14 (4): 388.
doi: 10.3390/pathogens14040388. PMID: 40333155; PMCID: PMC 12030430.
Адаптований переклад підготував Олексій Терещенко
Медична газета «Здоров’я України 21 сторіччя» № 16 (602), 2025 р
